金 朵，王高振，吳元元，吳文君，祁志軍

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院 農(nóng)藥研究所，陜西楊凌 712100；2.陜西省植物源農(nóng)藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100)

靶標(biāo)創(chuàng)新是農(nóng)藥創(chuàng)新的基礎(chǔ)，而基于化學(xué)蛋白組學(xué)分子靶標(biāo)導(dǎo)向的綠色農(nóng)藥創(chuàng)制是新農(nóng)藥創(chuàng)制的最新趨勢。例如，Robertson等[1]利用化學(xué)蛋白組學(xué)在果蠅Kc167細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)印楝素可直接結(jié)合到熱休克蛋白60(Hsp60)復(fù)合體上；Krishamoorthy等[2]以Bt毒素為探針并利用化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)，鑒定數(shù)十種作用于昆蟲中腸的靶蛋白。V-ATPase是一種保守的異聚體蛋白，廣泛分布于真核生物的質(zhì)膜和內(nèi)膜系統(tǒng)上[3]，是一種依賴ATP的質(zhì)子泵，由復(fù)合體V1和復(fù)合體V0組成，這兩部分結(jié)合時(shí)有活性，分離時(shí)無活性[4-6]。a亞基是復(fù)合體V0的重要組成部分，參與質(zhì)子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程[7-8]。V-ATPase在昆蟲生長、發(fā)育和生殖過程中具有重要作用。昆蟲中腸杯狀細(xì)胞頂端質(zhì)膜上的V-ATPase通過水解ATP產(chǎn)生能量，將中腸腔內(nèi)H+運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞中，維持中腸內(nèi)的堿性環(huán)境，有利于堿性蛋白發(fā)揮作用[9]。

東方粘蟲[Mythimnaseparata(Walker)]屬鱗翅目夜蛾科，主要危害玉米和小麥等禾本科作物，是亞洲和大洋洲許多國家農(nóng)作物上的重要害蟲之一，在中國、朝鮮、新西蘭等地發(fā)生較為嚴(yán)重[10]，曾在中國河北、內(nèi)蒙古、吉林、黑龍江、遼寧、天津、東北等地造成嚴(yán)重危害[11-12]。目前，對粘蟲的防治主要以化學(xué)防治為主。然而，隨著人們對化學(xué)農(nóng)藥造成的環(huán)境污染和害蟲抗藥性等問題的日益關(guān)注，環(huán)境友好型農(nóng)藥的創(chuàng)制已成為防治害蟲的重要途徑。苦皮藤素V等一系列二氫沉香呋喃類化合物作用于昆蟲的消化系統(tǒng)，可引起昆蟲中腸上皮細(xì)胞的嚴(yán)重病變[13-15]，且在昆蟲中腸上皮細(xì)胞的刷狀緣膜囊泡(BBMV)上存在苦皮藤素V的結(jié)合蛋白[16-17]。目前，已經(jīng)驗(yàn)證V-ATPase H亞基是苦皮藤素V的作用靶標(biāo)，并且發(fā)現(xiàn)MS-VATPa是苦皮藤素V的疑似作用靶標(biāo)[18-19]。然而，針對MS-VATPa是否為苦皮藤素V的作用靶標(biāo)尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

因此，本研究對東方粘蟲中腸MS-VATPa基因進(jìn)行克隆、原核表達(dá)與純化研究，以期為進(jìn)一步探索MS-VATPa的結(jié)構(gòu)與功能、苦皮藤素V與V-ATPase的分子作用機(jī)制以及基于MS-VATPa為篩選模型的新農(nóng)藥創(chuàng)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試?yán)ハx 東方粘蟲由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院農(nóng)藥研究所提供，在(25±1)℃、相對濕度為60%～70%的條件下，室內(nèi)人工飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 Trizol Reagent購自Invitrogen公司；5′-RACE和3′-RACE試劑盒、PrimeSTAR○RHS DNA Polymerase、DL5000 marker、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、快捷型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自西安熱默爾生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ購自NEB公司；Plasmid Mini Kit Ⅰ購自O(shè)mega公司；Ni-NTA agarose柱購自GE公司；蛋白marker購自北京索萊寶科技有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體、DAB顯色試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；原核表達(dá)載體pET-22b(+)的質(zhì)粒為西北農(nóng)林科技大學(xué)植保學(xué)院農(nóng)藥研究所實(shí)驗(yàn)室所保存；其余相關(guān)試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純均購自西安博美天成化玻有限公司。

1.1.3 主要儀器 超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，SW-CJ-2FD型)，PCR儀(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司，Hema 9700型)，旋渦混合器(江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司，QL-901型)，小型臺式離心機(jī)(Thermo Scientific Heraeus Pico)，冷凍離心機(jī)(Thermo Scientific Biofuge Stratos，sorvall ST16R)，GelDoc凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD公司)，紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司，TU-1810APC型)，電泳儀電源(北京六一儀器廠，DYY-6D型)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，DRP-9030型)，全溫振蕩培養(yǎng)箱(太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠，HZQ-F100型)，pH計(jì)(METTLER-TOLEDO公司)，Synergy超純水系統(tǒng)(Millipore 公司，Synergy型)，水浴鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取與第一鏈cDNA的合成 選取6齡東方粘蟲，嚴(yán)格按照Trizol Reagent說明書提取東方粘蟲中腸總RNA，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，并用紫外分光光度計(jì)測定OD260/OD280值。將提取的總RNA放入-80 ℃冰箱中保存，待用。以獲得的總RNA為模板，嚴(yán)格按照RT-PCR說明書反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，并放入-20 ℃冰箱，備用。

1.2.2 cDNA序列片段的的克隆 通過比對煙草天蛾(CAB55500.1_1)、小菜蛾(XP_011561281.1_1)和家蠶(XP_004931129.1_1)3種昆蟲的MS-VATPa基因序列，設(shè)計(jì)1對特異性引物aF和aR(表1)擴(kuò)增東方粘蟲MS-VATPa基因cDNA序列片段。PCR反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并將回收的PCR產(chǎn)物送至英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序。

1.2.3 5′和3′-RACE擴(kuò)增 根據(jù)獲得的cDNA部分序列設(shè)計(jì)特異性引物aGSPR和aGSPF(表1)，分別用于5′端和3′端序列的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 30 s；72 ℃ 3 min，共5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s；70 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，共5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s；68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將回收產(chǎn)物送去測序。

1.2.4 cDNA全長序列的獲得與驗(yàn)證 將“1.3.2”和“1.3.3”擴(kuò)增的序列進(jìn)行拼接獲得MS-VATPa全長序列，設(shè)計(jì)1對特異性引物QCaGSPF和QCaGSPR(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將回收產(chǎn)物送測序。

1.2.5 構(gòu)建重組載體 設(shè)計(jì)原核表達(dá)引物aEF和aER(表1)擴(kuò)增MS-VATPa基因編碼區(qū)，方法同“1.2.2”。將回收的擴(kuò)增產(chǎn)物與pET-22b(+)質(zhì)粒分別用NdeⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，把回收的酶切產(chǎn)物用T4連接酶連接構(gòu)建重組載體pET22b-MS-VATPa，并轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)，涂布平板，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑選陽性單克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增及酶切檢測，將檢測正確的陽性菌液送測序。

1.2.6 誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE檢測 將測序結(jié)果正確的陽性菌株接種于5 mL含有100 μg/mL 氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 過夜培養(yǎng)12 h；取0.5 mL菌液接種于50 mL含有100 μg/mL氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8。吸取2 mL 菌體離心(5 000 r/min，4 ℃，5 min)后，棄去上清，保留菌體沉淀。加入IPTG至終濃度分別為0.3、0.6、0.9 mmoL/L，在16 ℃、160 r/min條件下誘導(dǎo)表達(dá)20～24 h，離心(5 000 r/min，4 ℃，15 min)收集菌體，用Lysis buffer(50 mmol/L Tris-HCl、300 mmol/L NaCl、10 mmol/L咪唑，pH 7.4)重懸菌體，加入適量的溶菌酶和核酸酶，冰浴條件下超聲破碎菌體(功率100 W、工作時(shí)間6 s、間隔時(shí)間8 s、工作20～30 min)，離心(12 000 r/min，4 ℃，30 min)，分別收集上清和沉淀，并以SDS-PAGE電泳檢測目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況。

1.2.7 目標(biāo)蛋白的純化及Western blot驗(yàn)證 采用Ni-NTA柱親和層析法純化上述目標(biāo)蛋白粗提液，對收集的目標(biāo)蛋白洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測分析，并利用HRP標(biāo)記的抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體對純度較高的目標(biāo)蛋白進(jìn)行Western blot驗(yàn)證。

表1 試驗(yàn)所用引物Table 1 The primers used in the experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 cDNA全長序列的獲得與序列分析

將RT-PCR和RACE克隆獲得的部分序列拼接后獲得東方粘蟲中腸MS-VATPa全長序列，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳(圖1)后顯示：MS-VATPa基因的中間保守區(qū)片段、5′和3′-RACE及全長擴(kuò)增的目的條帶均與預(yù)期大小一致，表明成功克隆東方粘蟲MS-VATPa基因全長序列。利用生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)該基因cDNA全長序列為3 538 bp，開放閱讀框?yàn)? 511 bp，起始密碼子ATG，終止密碼子TAG，包含121 bp和905 bp的5′和3′非編碼區(qū)，編碼836個(gè)氨基酸，預(yù)測的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為95.75 ku，等電點(diǎn)(pI)為6.01，含有8個(gè)跨膜區(qū)(圖2)。目前，已經(jīng)獲得該基因的GenBank登錄號為KY921845。

M. DNA marker；A:1.MS-VATPa的中間片段 Intermediate fragment of MS-VATPa；B:1.MS-VATPa的5′-RACE產(chǎn)物 5′-RACE product of MS-VATPa，2.MS-VATPa的3′-RACE產(chǎn)物 3′-RACE product of MS-VATPa；C:1.MS-VATPa全長的擴(kuò)增產(chǎn)物 Amplification product of the full-length MS-VATPa

圖2 MS-VATPa編碼蛋白跨膜區(qū)預(yù)測Fig.2 Prediction of the transmembrane regions of the encoded protein of MS-VATPa

2.2 同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST搜索發(fā)現(xiàn)東方粘蟲MS-VATPa氨基酸序列與其他昆蟲V-ATP酶a亞基氨基酸序列的一致性為75%～94%。通過多重序列比對發(fā)現(xiàn)不同物種間該基因編碼氨基酸序列的差異不明顯。采用MEGA 6.0中Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)，可以看出東方粘蟲與煙草天蛾(Manducasexta)、棉紅鈴蟲(Pectinophoragossypiella)、小菜蛾(Plutellaxylostella)、臍橙螟(Amyeloistransitella)、家蠶(Bombyxmori)、玉帶鳳蝶(Papiliopolytes)、柑橘鳳蝶(Papilioxuthus)等鱗翅目昆蟲V-ATP酶a亞基具有較高同源性，進(jìn)一步明確該序列的正確性。

圖3 東方粘蟲與其他昆蟲MS-VATPa氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on amino acid sequences of MS-VATPa of M.separate and other insects

2.3 重組載體的構(gòu)建與鑒定

以提取的重組質(zhì)粒pET22b-MS-VATPa為模板進(jìn)行PCR檢測(圖4)，結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶大小與預(yù)期相符。經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定(圖5)，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pET22b-MS-VATPa經(jīng)雙酶切后的載體條帶與陰性對照基本一致，目的基因條帶與預(yù)期大小基本相符。另外，重組子的測序結(jié)果顯示亞克隆于pET-22b(+)載體的基因序列與目的基因序列大小一致。這表明成功構(gòu)建重組表達(dá)載體pET22b-MS-VATPa。

M． DL2000 DNA marker；1.pET22b-MS-VATPa質(zhì)粒的擴(kuò)增產(chǎn)物 Amplification product of pET22b-MS-VATPa plasmid

M.DL5000 DNA marker；1.pET22b-MS-VATPa重組質(zhì)粒 The recombination plasmid of pET22b-MS-VATPa；2.pET22b-MS-VATPa雙酶切產(chǎn)物 Double enzyme digestion product of pET22b-MS-VATPa

2.4 pET22b-MS-VATPa誘導(dǎo)表達(dá)及純化分析

將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET22b-MS-VATPa轉(zhuǎn)入BL21(DE3)菌株經(jīng)不同濃度IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(圖6)發(fā)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的條帶與預(yù)測分子質(zhì)量相符。另外，純化后的目標(biāo)蛋白的SDS-PAGE電泳檢測(圖7-A)和Western blot驗(yàn)證(圖7-B)結(jié)果顯示：表達(dá)1條帶有6個(gè)His-tag的MS-VATPa融合蛋白，且條帶大小約為96.6 ku，與理論預(yù)測值相一致。這表明成功實(shí)現(xiàn)MS-VATPa在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) Protein molecular mass marker；1、5、9.pET22b-MS-VATPa在加IPTG誘導(dǎo)前的表達(dá)產(chǎn)物 The expression products of pET22b-MS-VATPa before inducing with IPTG；2、6、10.pET22b-MS-VATPa分別在0.3、0.6 和1 mmoL·L-1 IPTG條件下誘導(dǎo)的表達(dá)產(chǎn)物 The expression products of pET22b-MS-VATPa with 0.3, 0.6 and 1 mmoL·L-1 IPTG, respectively；3、7、11.pET22b-MS-VATPa經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后超聲破碎的上清 The ultrasonication supernatant of pET22b-MS-VATPa induced with IPTG；4、8、12.pET22b-MS-VATPa經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后超聲破碎的沉淀 The ultrasonication precipitation of pET22b-MS-VATPa by inducing with IPTG

圖6pET22b-MS-VATPa的原核表達(dá)
Fig.6ProkaryoticexpressionofpET22b-MS-VATPa

3 討論與結(jié)論

近年來，新農(nóng)藥的創(chuàng)制轉(zhuǎn)變?yōu)橐苑肿影袠?biāo)為導(dǎo)向的農(nóng)藥創(chuàng)制，而以天然活性物質(zhì)為探針是發(fā)現(xiàn)新靶標(biāo)的研究熱點(diǎn)。本研究克隆獲得的MS-VATPa基因預(yù)測編碼蛋白含有8個(gè)跨膜螺旋，與其他文獻(xiàn)報(bào)道的V-ATPase a亞基含有8個(gè)跨膜螺旋一致[20-21]。通過對MS-VATPa序列同源相似性搜索發(fā)現(xiàn)東方粘蟲與多種鱗翅目昆蟲 V-ATPase a亞基序列具有較高同源性，所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹也表現(xiàn)出相似的結(jié)果，且該序列與多種昆蟲V-ATPase a1亞型具有較高的同源性。

A:MS-VATPa重組蛋白的SDS-PAGE分析 SDS-PAGE analysis of the MS-VATPa recombianant protein，1. MS-VATPa重組蛋白 MS-VATPa recombianant protein;B:MS-VATPa重組蛋白Western blot分析 Western blot analysis of the MS-VATPa recombianant protein，1. MS-VATPa重組蛋白 MS-VATPa recombianant protein

這些結(jié)果表明MS-VATPa基因與多種昆蟲V-ATPase a亞基既具有較高的保守性，又存在一定程度的差異，進(jìn)一步證明所得MS-VATPa序列的準(zhǔn)確性。

在本研究中，針對東方粘蟲MS-VATPa基因構(gòu)建pET22b-MS-VATPa原核表達(dá)載體，該載體上有6個(gè)His-tag，能夠與Ni-NTA柱中的Ni2+相互結(jié)合，便于目標(biāo)蛋白的純化。SDS-PAGE和Western blot分析結(jié)果表明成功表達(dá)出MS-VATPa融合蛋白。然而，在實(shí)際誘導(dǎo)表達(dá)中，該融合蛋白的表達(dá)量相對較低，分析原因可能是由于其在進(jìn)行原核表達(dá)時(shí)受多種因素影響，例如，表達(dá)載體和宿主菌的選擇、誘導(dǎo)條件(如溫度、時(shí)間、濃度)、目標(biāo)蛋白本身的特性等，具體原因有待進(jìn)一步研究確定。

近年來，越來越多的研究者發(fā)現(xiàn)利用RNAi技術(shù)可以使昆蟲V-ATPase基因的表達(dá)量降低，進(jìn)而導(dǎo)致昆蟲死亡[22]。有報(bào)道[23]稱V-ATPase基因突變會引起運(yùn)輸障礙及昆蟲死亡。Ahmed利用RNAi干擾技術(shù)沉默棉紅鈴蟲體內(nèi)a亞基基因，能夠降低其表達(dá)水平而導(dǎo)致害蟲死亡[24]。V-ATPase還參與昆蟲對Bt毒素和農(nóng)藥的抗性作用[25-26]。此外，研究者[27-29]發(fā)現(xiàn)Bafilomycins和Conannamycins兩類V-ATPase抑制劑能與a亞基結(jié)合而影響質(zhì)子的轉(zhuǎn)運(yùn)。這不僅說明V-ATPase a亞基在昆蟲體內(nèi)具有重要的作用，也為農(nóng)藥的創(chuàng)制提供新的思路。

本研究從東方粘蟲中腸首次克隆獲得V-ATP酶a亞基基因cDNA全長序列，并對其相關(guān)分子特性進(jìn)行分析，成功實(shí)現(xiàn)MS-VATPa基因在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)。該研究結(jié)果為進(jìn)一步探究東方粘蟲MS-VATPa的生物學(xué)功能，苦皮藤素V與V-ATP酶的分子作用機(jī)制，以及基于MS-VATPa為靶標(biāo)的新藥篩選模型提供重要基礎(chǔ)。

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