彭靜，羊忠山，李玉卿，袁嘉麗

云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500

下呼吸道細(xì)菌定植常見于慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)穩(wěn)定期患者，定植的細(xì)菌作為刺激物有可能導(dǎo)致氣道炎癥及肺功能降低，并且當(dāng)細(xì)菌負(fù)荷超過閾值時就會產(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致COPD加重。玉屏風(fēng)散加味方具有益氣、滌痰、逐瘀的功效，臨床用于治療COPD療效顯著。本實驗從細(xì)菌定植的角度觀察玉屏風(fēng)散加味方治療COPD的作用機(jī)制，為該方的進(jìn)一步推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF級雄性Wistar大鼠50只，體質(zhì)量(250±20)g，購于成都達(dá)碩生物科技有限公司，動物合格證號SCXK(川)2013-0024，飼養(yǎng)于云南中醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。

1.2 實驗藥物 玉屏風(fēng)散加味方由黃芪、白術(shù)、防風(fēng)、桑白皮、浙貝母、白芥子、三七、莪術(shù)8味中藥組成，由云南中醫(yī)學(xué)院附屬中醫(yī)醫(yī)院藥房提供，均為《中國藥典》所載品種，由云南中醫(yī)學(xué)院中藥鑒定教研室鑒定其品種和質(zhì)量。全方生藥總量129 g，以成人每天治療劑量根據(jù)大鼠體表面積換算為其等效劑量，此劑量作為中劑量組，低、中、高劑量的濃度分別為 4.644 g/(kg·d)、9.288 g/(kg·d)、27.864 g/(kg·d)。

1.3 試劑及儀器 紅河牌香煙(紅河卷煙廠，煙堿含量10mg/支)，脂多糖(LPS，Sigma公司，批號L2880)，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(Sangon Biotech公司，批號SK8256)，熒光定量PCR試劑盒(Applied Biosystems公司，批號 4472908)，ABI 7500熒光定量 PCR儀(Applied Biosystems公司)，F(xiàn)lurochem9900-50數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)(Alpha Innotech corporation公司)。

1.4 動物分組及模型制備 SPF級雄性Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為正常組、模型組、玉屏風(fēng)散加味方低劑量組(低劑量組)、玉屏風(fēng)散加味方中劑量組(中劑量組)、玉屏風(fēng)散加味方高劑量組(高劑量組)5組，每組10只。除正常組外，其余4組大鼠分別于第1、8、15、22天給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，氣管內(nèi)注入LPS200μL，第2～28天(注射LPS當(dāng)天除外)上午將大鼠置于自制密閉的有機(jī)玻璃箱內(nèi)，注入5%(煙霧的容積/煙熏箱的容積)紅河牌香煙煙霧，30min/d，共28天；第29天開始，隔天煙熏霧化1次，30min/d，直至第112天。正常組不予煙熏，但采用相同的方法氣管內(nèi)滴入等量的生理鹽水。由于實驗過程中操作不當(dāng)導(dǎo)致部分大鼠死亡，因此結(jié)果中各組大鼠數(shù)量不等于10。

1.5 干預(yù)方法 第84天起，每天灌胃給藥1次，中劑量組為9.288 g/(kg·d)，低、中、高劑量的比例為0.5∶1∶3，連續(xù)給藥28天。正常組和模型組以無菌蒸餾水灌胃。

1.6 指標(biāo)檢測 給藥結(jié)束后的第2天將大鼠處死后取材，無菌條件收集大鼠左肺支氣管肺泡灌洗液(BALF)，采用Miseq測序平臺進(jìn)行鏈球菌、奈瑟菌、葡萄球菌、黃桿菌屬、檸檬酸細(xì)菌屬、彎曲菌屬6類細(xì)菌相對含量的高通量檢測。取大鼠右肺組織制作病理切片，在固定液中固定，用乙醇進(jìn)行梯度脫水，用二甲苯透明后進(jìn)行浸蠟和包埋，切片后完成HE染色。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量資料以(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 見圖1。正常組大鼠支氣管上皮完整，管腔內(nèi)無明顯滲出與炎性細(xì)胞浸潤；模型組大鼠氣道及各級支氣管黏膜下可見不同程度的慢性炎癥細(xì)胞(包括淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞及單核細(xì)胞)和少量中性粒細(xì)胞浸潤，支氣管平滑肌厚度明顯增加、支氣管纖毛柱狀上皮部分脫落、纖毛粘連倒伏、變形壞死，氣道上皮復(fù)層化，杯狀上皮細(xì)胞增生，肺小動脈管壁增厚，部分肺泡擴(kuò)張融合。與模型組比較，中、高劑量組大鼠支氣管病理改變明顯減輕，而低劑量組大鼠支氣管病理改善不明顯。

2.2 各組大鼠氣道6類細(xì)菌相對含量比較 見表1。與正常組比較，模型組大鼠氣道鏈球菌、奈瑟菌、葡萄球菌、黃桿菌屬、檸檬酸細(xì)菌屬、彎曲菌屬相對含量均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，低劑量組大鼠氣道鏈球菌、奈瑟菌、彎曲菌屬、黃桿菌屬、葡萄球菌相對含量明顯降低(P＜0.05)，中劑量組大鼠氣道檸檬酸細(xì)菌屬、黃桿菌屬、葡萄球菌相對含量明顯降低(P＜0.05)，而高劑量組6類細(xì)菌相對含量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

圖1 HE染色切片比較圖(×100)

表1 各組大鼠6類細(xì)菌相對含量比較(±s) %

表1 各組大鼠6類細(xì)菌相對含量比較(±s) %

與正常組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組 別正常組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n87977鏈球菌0.417±0.062 0.777± 0.128①0.429± 0.075②0.443±0.115 0.512±0.068奈瑟菌0.039±0.009 0.088± 0.017①0.042± 0.010②0.063±0.010 0.063±0.009葡萄球菌0.189±0.034 0.321± 0.048①0.162± 0.030②0.146± 0.028②0.239±0.056黃桿菌屬0.041±0.010 0.403± 0.172①0.027± 0.003②0.032± 0.014②0.173±0.031檸檬酸細(xì)菌屬0.306±0.078 3.629± 1.432①2.151±1.072 0.257± 0.081②1.129±0.755彎曲菌屬0.063±0.011 0.128± 0.025①0.071± 0.013②0.120±0.039 0.093±0.013

3 討論

玉屏風(fēng)散加味方中8味中藥均有不同程度的抑菌作用。黃芪對痢疾桿菌、肺炎雙球菌、溶血性鏈球菌A、B、C及金黃色、檸檬色、白色葡萄球菌等均有抑制作用[1]；白術(shù)揮發(fā)油對鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌和草綠色鏈球菌的抑制作用較明顯，抑菌率達(dá)95%以上[2]；防風(fēng)具有抗菌和抗炎作用，其對金黃色葡萄球菌、二型溶血性鏈球菌、肺炎雙球菌等均有抑制作用[3]；有文獻(xiàn)指出，桑白皮甾醇對細(xì)菌的抑制作用強(qiáng)弱順序依次為：大腸桿菌＞枯草芽孢桿菌＞志賀氏菌＞金黃色葡萄球菌[4]；海南溫莪術(shù)揮發(fā)油對白色念珠菌、白色葡萄球菌、四聯(lián)球菌、金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌、大腸桿菌及枯草芽孢桿菌都有抑制作用[5]。此外，浙貝母、白芥子、三七也有較好的抗炎抗病毒作用。本方8味中藥相輔相成，共同發(fā)揮著抑菌作用。

本實驗選取的鏈球菌和葡萄球菌是革蘭氏陽性菌，其余4類細(xì)菌都是革蘭氏陰性菌。其中葡萄球菌多數(shù)為非致病菌，少數(shù)可導(dǎo)致疾病，是最常見的化膿性球菌，也是醫(yī)院交叉感染的重要來源，代表菌種有金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌等。劉雪梅等[6]對COPD穩(wěn)定期及急性加重期(AECOPD)患者痰標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌學(xué)分析，篩查常見致病菌的感染情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌在AECOPD檢出率明顯高于穩(wěn)定期，說明金黃色葡萄球菌感染是一部分AECOPD的發(fā)病原因之一。裴琦等[7]分析了重度COPD患者下呼吸道細(xì)菌感染情況，結(jié)果顯示主要革蘭陽性病原菌以金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌為主。鏈球菌廣泛存在于自然界人及動物糞便、健康人鼻咽部中，大多數(shù)不致病，與COPD密切相關(guān)的主要是肺炎鏈球菌，有文獻(xiàn)報道COPD患者肺炎鏈球菌檢出率明顯增高[8]。

淋病奈瑟菌和腦膜炎奈瑟菌是引起人類疾病的常見病原性奈瑟菌，其他菌種則屬于寄生在人體上呼吸道的正常菌群或條件致病菌。汪洋[9]的實驗表明COPD患者口咽部菌群的優(yōu)勢菌群以草綠色鏈球菌和奈瑟氏菌為主，檢出率為100%。黃桿菌屬是一種非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，是以產(chǎn)生黃色素為特征的一個菌屬，可引起肺炎，也可招致腦膜炎、敗血癥等疾病。該病的致病力不強(qiáng)，為條件致病菌，一般情況下不引起感染，但在機(jī)體免疫力下降時可能引起感染。孫健龍等[10]研究發(fā)現(xiàn)黃桿菌屬引起的下呼吸道感染多發(fā)生在老年、有基礎(chǔ)疾病、應(yīng)用廣譜抗菌藥、進(jìn)行機(jī)械通氣治療的患者，且耐藥率較高。檸檬酸細(xì)菌屬是腸細(xì)菌科中的革蘭氏陰性、可運動的細(xì)菌，此菌屬多與醫(yī)院感染有關(guān)，在臨床實驗室中，尿液、血液和腦脊液等標(biāo)本都能分離到該細(xì)菌。標(biāo)本來源方面以痰標(biāo)本為主，其次為外科傷口拭子和尿液，該菌對大多數(shù)抗菌藥物仍具有較高的敏感性。彎曲菌屬是一類微需氧菌，對人類致病的主要是空腸彎曲菌和胎兒彎曲菌胎兒亞種，前者是人類腹瀉最常見的病原菌之一，后者在免疫功能低下時可引起敗血癥、腦膜炎等。

綜上，此6類細(xì)菌雖然不是COPD下呼吸道感染常見檢出率較高的細(xì)菌，與COPD的相關(guān)報道也較少見，但本實驗結(jié)果顯示，造模后這6類細(xì)菌相對含量確實顯著升高，提示它們與COPD的發(fā)病相關(guān)，而用玉屏風(fēng)散加味方干預(yù)后它們的相對含量均有不同程度的下降，說明該方能減輕這些細(xì)菌的定植量，緩解COPD炎癥，且以低、中劑量組效果較佳，這對我們臨床運用該方具有一定的指導(dǎo)意義。

[1] 孫政華，邵晶，郭玫．黃芪化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J]．中醫(yī)臨床研究，2015，7(25)：22-25．

[2] 張雪青，邵鄰相，吳文才，等．白術(shù)揮發(fā)油抑菌及抗腫瘤作用研究[J]．浙江師范大學(xué)學(xué)報，2016，39(4)：436-442.

[3] 劉雙利，姜程曦，趙巖，等．防風(fēng)化學(xué)成分及其藥理作用研究進(jìn)展[J]．中草藥，2017，48(10)：2146-2152．

[4] 徐艷陽，蔡森森，于靜．桑白皮甾醇對亞硝酸鹽的清除效果及抑菌活性研究[J]．現(xiàn)代食品科技，2014，30(2)：53-57．

[5] 莫崢嶸，邢福佳，楊平，等．海南溫莪術(shù)揮發(fā)油的抑菌活性及提取工藝研究[J]．海南師范大學(xué)學(xué)報，2016，29(3)：274-276．

[6] 劉雪梅，楊嵐．聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法篩查慢性阻塞性肺疾病常見致病菌[J]．西安交通大學(xué)學(xué)報，2013，34(1)：68-72．

[7] 裴琦，劉霄，劉敬禹，等．重度慢性阻塞性肺疾病患者下呼吸道多藥耐藥菌感染的臨床特點及病原學(xué)分析[J]．中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2014，24(5)：1152-1154．

[8] 徐雪梅，吳思穎，謝軼，等．慢性阻塞性肺疾病合并下呼吸道感染患者病原菌分布與耐藥性分析[J]．成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2017，12(2)：175-181．

[9] 汪洋．慢性阻塞性肺疾病緩解期患者聯(lián)合吸入沙美特羅/氟替卡松后口咽部微生態(tài)菌群和唾液SIgA及溶菌酶水平變化的研究[D]．昆明：昆明醫(yī)科大學(xué)，2015．

[10] 孫健龍，張素梅，管曉蕓，等．機(jī)械通氣致下呼吸道黃桿菌屬感染的臨床研究[J]．中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2012，22(11)：2420-2422．