蔣一飛，范坤，梅亞寧，劉成成(.宿州市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽宿州34000；.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)學(xué)部，南京009)

奈瑟菌屬(Neisseria)目前包括28個(gè)菌種，大部分屬于人和動(dòng)物黏膜正常菌群，其中約10余種可從人體分離[1]。除了淋病奈瑟菌和腦膜炎奈瑟菌，其他大多數(shù)與人類相關(guān)的奈瑟菌均是上呼吸道正常菌群，可引起機(jī)會(huì)性感染，常見(jiàn)有淺黃奈瑟菌(Neisseriaflavescens)、微黃奈瑟菌(Neisseriasubflava)、灰色奈瑟菌(Neisseriasubflava)、長(zhǎng)奈瑟菌(Neisseriaelongata)等。其中，微黃奈瑟菌引起的感染報(bào)道較少，可造成患者腦膜炎、菌血癥等[2-4]。近來(lái)，宿州市第一人民醫(yī)院診治1例微黃奈瑟菌引起尿路感染合并菌血癥患者，報(bào)道如下。

1 病歷摘要

患者男，76歲，因“進(jìn)行性排尿困難半年，加重2 d伴發(fā)熱”于2019年7月14日入院?；颊甙肽昵盁o(wú)明顯誘因出現(xiàn)排尿困難，表現(xiàn)為尿頻、尿痛、排尿時(shí)間延長(zhǎng)、夜尿增多。曾留置導(dǎo)尿治療，近2日來(lái)排尿困難明顯加重，伴有畏寒、發(fā)熱，最高體溫達(dá)40 ℃，遂就診于宿州市第一人民醫(yī)院泌尿外科。體格檢查：T：38.6 ℃，BP：171/100 mmHg，R：21次/min，雙肺呼吸音粗，未及干濕啰音；心率124次/min，律尚齊，心音可；腹平軟，無(wú)壓痛及反跳痛。前列腺約2度大，質(zhì)韌，飽滿，中央溝消失，未及硬結(jié)，無(wú)觸痛。血常規(guī)：WBC 15.08×109/L，N 90.40%，血降鈣素原(PCT)27.1 ng/mL；尿常規(guī)：尿白細(xì)胞酯酶1+，尿WBC 25個(gè)/μL，尿隱血2+，尿紅細(xì)胞58個(gè)/μL。CT示：膀胱多發(fā)結(jié)石，左輸尿管下端結(jié)石伴左側(cè)腎盂輸尿管擴(kuò)張；前列腺肥大伴鈣化。入院后采集血培養(yǎng)及中段尿培養(yǎng)均檢出微黃奈瑟菌。就診當(dāng)日靜脈輸注頭孢哌酮/舒巴坦聯(lián)合左氧氟沙星經(jīng)驗(yàn)性治療并留置導(dǎo)尿管。治療1周，患者發(fā)熱癥狀消除，且尿液逐漸由渾濁變至澄清。而后，行左側(cè)輸尿管鏡碎石取石術(shù)+經(jīng)尿道膀胱碎石取石術(shù)，術(shù)后恢復(fù)良好，予以出院。

2 微生物學(xué)檢查及結(jié)果

2.1細(xì)菌培養(yǎng) 患者入院后，隨即送檢血培養(yǎng)(需氧瓶和厭氧瓶各1瓶)和中段尿培養(yǎng)。血培養(yǎng)采用美國(guó)BD公司BactecTMFX400血培養(yǎng)儀進(jìn)行，需氧瓶培養(yǎng)18 h報(bào)陽(yáng)性，厭氧瓶培養(yǎng)5 d未報(bào)陽(yáng)性。陽(yáng)性瓶涂片革蘭染色(珠海貝索公司)見(jiàn)革蘭陰性雙球菌，成對(duì)排列(圖1A)。轉(zhuǎn)種血瓊脂平板和巧克力平板(鄭州博賽公司)，置35 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h見(jiàn)直徑1～2 mm、黃色、圓形、半透明、光滑、反光、邊緣整齊、黏稠小菌落(圖1B、C)，菌落涂片革蘭染色同陽(yáng)性瓶結(jié)果(圖1D)。中段尿接種血瓊脂平板和麥康凱平板，置35 ℃培養(yǎng)箱24 h，血瓊脂平板可見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)(菌落計(jì)數(shù)>105個(gè)/mL)，菌落形態(tài)及革蘭染色結(jié)果同血培養(yǎng)結(jié)果，而麥康凱平板未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)。血培養(yǎng)和尿培養(yǎng)分離菌株分別命名為Strain B和Strain U。

2.2菌種鑒定

2.2.1生化鑒定 2株細(xì)菌觸酶試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)均陽(yáng)性,氧化分解葡萄糖、麥芽糖、果糖，不分解乳糖、蔗糖。用法國(guó)生物梅里埃Vitek 2 Compact配套NH卡鑒定，結(jié)果均為干燥奈瑟菌(Neisseriasicca)，鑒定率和生物編碼分別為93%和0637410010、98%和0633400000。質(zhì)控菌株為嚙蝕艾肯菌ATCC BAA-1152。

2.2.2質(zhì)譜鑒定 用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)分析儀(法國(guó)生物梅里埃公司)鑒定，結(jié)果均為黃色/深黃/微黃奈瑟菌(Neisseriaflave/perflave/subflava)，置信度：99.9%。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 8739。

2.2.316S rRNA基因測(cè)序 用16S rRNA基因測(cè)序法，通用引物(27F/1492R)合成及雙向基因測(cè)序由南京擎科生物公司完成。引物序列為：F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAGC-3′，R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)，Strain B與參比菌株微黃奈瑟菌(NR_041989.1)、深黃奈瑟菌(NR_117694.1)、黏膜奈瑟菌(NR_117696.1)的同源性為前3位，依次為99.85%、99.20%和98.26%；Strain U的比對(duì)結(jié)果為：微黃奈瑟菌(NR_041989.1)99.78%、深黃奈瑟菌(NR_117694.1)99.13%、黏膜奈瑟菌(NR_117696.1)98.19%。

2.2.450 S核糖體蛋白L6片段基因(fragment of the 50 S ribosomal protein L6，rplF)測(cè)序rplF基因擴(kuò)增及比對(duì)參考Bennett等[5]建立的方法。引物合成及基因雙向測(cè)序由南京擎科生物公司完成。引物序列為：F：5′-CAGTGACTGTTCCCG

CTGGTGT-3′，R：5′-AGGYTCAGGAGKWCGGAAHG-3′。 測(cè)序結(jié)果顯示，Strain B與Strain U的rplF基因序列相同。經(jīng)PubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubmlst.org/bigsdb?db=pubmlst_rmlst_seqdef_kiosk)比對(duì)，最佳匹配種屬為微黃奈瑟菌[BACT000035(rplF)：823]。

2.3藥敏試驗(yàn) 參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI) M45-A3卡他莫拉菌標(biāo)準(zhǔn)，選用M-H瓊脂培養(yǎng)基，用E-test(鄭州安圖生物公司)和K-B法(英國(guó)Oxoid公司)檢測(cè)菌株藥物敏感性，結(jié)果見(jiàn)表1。用頭孢硝噻吩法(法國(guó)生物梅里埃公司)檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶活性，結(jié)果均為陰性。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922與金黃色葡萄球菌ATCC 25923。

表1 2株細(xì)菌抗菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本患者血液和尿液中分離的2株細(xì)菌最終鑒定為微黃奈瑟菌，且二者藥敏結(jié)果相近，提示來(lái)源可能相同。Janda等[6]曾報(bào)道1名先天性尿道結(jié)構(gòu)異常兒童患者，由于長(zhǎng)期自行導(dǎo)尿發(fā)生微黃奈瑟菌引起的尿路感染。而本文報(bào)道該老年患者，不僅有泌尿道感染體征，還有菌血癥等全身癥狀。結(jié)合該患者泌尿系統(tǒng)結(jié)石、前列腺增生、留置導(dǎo)尿管的病史，我們推測(cè)經(jīng)泌尿道逆行感染的可能性大。

Vitek 2配套NH卡可提供部分奈瑟菌屬細(xì)菌的鑒定能力，但其鑒定范圍不包含微黃奈瑟菌，因此將其誤鑒定為干燥奈瑟菌，但干燥奈瑟菌常見(jiàn)菌落形態(tài)與微黃奈瑟菌相比較差異較大。干燥奈瑟菌多為干燥、有皺紋、灰白色菌落，而微黃奈瑟菌屬細(xì)菌多為光滑、產(chǎn)黃色素菌落。因此，隨后將2株細(xì)菌行質(zhì)譜鑒定，結(jié)果為黃色/深黃/微黃奈瑟菌。最近的基因組分析表明，微黃奈瑟菌應(yīng)重新歸為微黃奈瑟菌屬的一個(gè)變種[7]。微黃奈瑟菌屬即包括上述黃色奈瑟菌、深黃奈瑟菌、微黃奈瑟菌。16S rRNA序列分析是奈瑟菌屬鑒定、分類的重要手段[8]。通過(guò)對(duì)2株細(xì)菌進(jìn)行16S rRNA測(cè)序和核酸比對(duì)顯示符合率最高的為微黃奈瑟菌。然而，最高的前2位菌種(微黃奈瑟菌、深黃奈瑟菌)間比對(duì)符合率差異未超過(guò)0.8%，所以用16S rRNA測(cè)序方法尚不能準(zhǔn)確鑒定到種。rplF基因已被證明在奈瑟菌屬鑒定中具有更高的分辨率[1]。rplF基因測(cè)序結(jié)果顯示，2株細(xì)菌測(cè)序結(jié)果相同且經(jīng)PubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)的最佳匹配菌種為微黃奈瑟菌。此外，糖類利用試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌株分解葡萄糖、麥芽糖、果糖，不分解乳糖、蔗糖，與黃紅勛報(bào)道的結(jié)果一致[4]。而深黃奈瑟菌可分解蔗糖，所以可將深黃奈瑟菌排除。

目前CLSI尚無(wú)微黃奈瑟菌的藥敏推薦方法。本文試探性地對(duì)幾種臨床常用藥物進(jìn)行敏感性試驗(yàn)。結(jié)果顯示2株菌株的藥敏數(shù)據(jù)差異均在1～2個(gè)梯度以內(nèi)，其中氨芐西林、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢曲松、亞胺培南和美羅培南具有較低的最低抑菌濃度(MIC)?；仡櫛纠颊叩闹委?，入院后經(jīng)驗(yàn)性使用頭孢哌酮/舒巴坦治療后發(fā)熱癥狀迅速緩解。雖然左氧氟沙星的MIC值高達(dá)8.0 μg/mL，但其在尿液中的藥物濃度遠(yuǎn)大于血藥濃度，仍可能會(huì)對(duì)尿路中微黃奈瑟菌有效。除外抗菌藥物治療，解除尿路梗阻并保持尿液引流通暢也是該病例治療成功的關(guān)鍵。綜合其他一些感染案例[3,9-10]，微黃奈瑟菌的機(jī)會(huì)致病性感染可能與年齡、免疫力低下以及侵襲性操作有關(guān)。由于實(shí)驗(yàn)條件限制，未使用脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)、多位點(diǎn)序列分型(MLST)等分子生物學(xué)方法對(duì)2株細(xì)菌進(jìn)行同源性分析。