吳玲，鄒鳳梅，王欣，魏勤，李軍春，劉剛，李可可，王曉寧，張蕾

(甘肅省人民醫(yī)院檢驗中心，甘肅省醫(yī)學(xué)檢驗臨床醫(yī)學(xué)研究中心，蘭州730000)

根據(jù)《伯杰系統(tǒng)細菌學(xué)手冊》第2版，奈瑟菌屬(Neisseria)隸屬于β-變形菌綱，奈瑟菌目，奈瑟菌科。奈瑟菌屬的細菌對黏膜的親和力強，可從人體中分離出多個菌種，包括淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)、腦膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)、灰色奈瑟菌(N.cinerea)、淺黃奈瑟菌(N.flavescens)、乳糖奈瑟菌(N.Lactamica)、黏膜奈瑟菌(N.mucosa)、多糖奈瑟菌(N.polysaccharea)、干燥奈瑟菌(N.sicca)和微黃奈瑟菌(N.subflava)等多個菌種。一些菌種主要來自于動物，如動物奈瑟菌(N.animalis)、動物口腔奈瑟菌(N.animaloris)、動物咬傷奈瑟菌(N.zoodegmatis，來自貓和犬的咽部)、反消化奈瑟菌(N.denitrificans，來自于豚鼠咽喉)、牙斑奈瑟菌(N.dentiae，來自飼養(yǎng)牛牙斑)、編織奈瑟菌(N.weaveri，來自犬的口腔菌群)和恒河猴奈瑟菌(Neisseriamacacae，來自恒河猴的口咽部)[1]。除腦膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌外，其余奈瑟菌引起人類感染的報道較少。恒河猴奈瑟菌1983年首次在恒河猴(獼猴)身上被發(fā)現(xiàn)[2]，而感染人的報道極為有限?，F(xiàn)將從關(guān)節(jié)竇道穿刺液中分離引起膝關(guān)節(jié)感染的恒河猴奈瑟菌報道如下。

1 病歷摘要

患者女性，76歲，患類風濕關(guān)節(jié)炎和2型糖尿病，2020年8月行“右膝關(guān)節(jié)置換術(shù)”。術(shù)后約8個月，即2021年4月，右膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹，活動受限，右膝髕骨處可見一長約20 cm的手術(shù)瘢痕組織，髕下可見一大小約0.3 cm×0.3 cm未愈竇道，持續(xù)有淡黃色液體滲出，局部皮溫增高，外院診斷為“右膝關(guān)節(jié)假體植入感染”，取患者竇道內(nèi)側(cè)關(guān)節(jié)腔穿刺液做細菌培養(yǎng)。實驗室檢查：白細胞計數(shù)：6.66×109/L，中性粒細胞百分率：73.3%，紅細胞沉降率：80 mm/h，C反應(yīng)蛋白：98.65 mg/L，白介素-6:64.76 pg/mL，降鈣素原：0.18 ng/mL，類風濕因子：138 IU/mL，抗角蛋白抗體：陽性，抗環(huán)瓜氨酸肽抗體：>500 U/mL,空腹血糖：6.33 mmol/L。臨床診斷：膝關(guān)節(jié)假體植入感染，類風濕關(guān)節(jié)炎和2型糖尿病。臨床治療中每日給予患者氯化鈉注射液(100 mL)+頭孢曲松鈉(2 g, ivgtt, q12h)治療2周，效果顯著，病情穩(wěn)定后出院。

2 細菌的分離培養(yǎng)與鑒定結(jié)果

2.1細菌的分離與培養(yǎng) 按照《臨床檢驗操作規(guī)程》第4版，用接種環(huán)挑取黃色、微渾濁的竇道穿刺液，分別接種于哥倫比亞血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板和麥康凱瓊脂平板上，放入35 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；同時竇道穿刺液直接涂片，革蘭染色。涂片染色結(jié)果：白細胞較多，在白細胞內(nèi)可見革蘭陰性雙球菌。培養(yǎng)24 h生長情況：哥倫比亞血瓊脂平板上菌落有大小2種，小的約1 mm、大的約2 mm，光滑、濕潤、灰白色、無溶血；巧克力瓊脂平板上菌落同樣有大小2種，菌落大小同哥倫比亞血瓊脂平板，光滑、濕潤、灰白色。麥康凱瓊脂平板未生長；沙氏瓊脂平板未生長。培養(yǎng)48 h生長情況：哥倫比亞血瓊脂平板與24 h生長情況一致，略有區(qū)別的是小菌落約2 mm、大的約3 mm、出現(xiàn)淡淡的黃色素，見圖1。巧克力瓊脂平板除菌落約增大至2～4 mm外，生長情況同24 h。麥康凱瓊脂平板不生長；沙氏瓊脂平板未生長。純菌涂片革蘭染色：革蘭陰性雙球菌。哥倫比亞瓊脂平板和巧克力瓊脂平板購自鄭州安圖生物公司，麥康凱瓊脂平板和沙氏瓊脂平板為實驗室自制。

圖1 細菌在哥倫比亞血瓊脂平板5% CO2環(huán)境溫育48 h生長情況

2.2細菌鑒定

2.2.1常規(guī)鑒定 氧化酶陽性，觸酶陽性，硝酸鹽還原試驗陰性，β-內(nèi)酰胺酶試驗陽性，以金黃色葡萄球菌ATCC 29213作陽性對照，以金黃色葡萄球菌 ATCC 25923為陰性對照(頭孢硝噻酚紙片購自O(shè)xoid公司)；用生物梅里埃奈瑟菌和嗜血桿菌鑒定盒(比色法API NH 10400)進行鑒定，鑒定碼為5333，被鑒定為副流感嗜血桿菌，其鑒定%與T值均不顯示，表明用此方法不能準確鑒定。

2.2.2質(zhì)譜技術(shù)鑒定 用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)技術(shù)進行鑒定，用BRUKER microflex鑒定，結(jié)果為Neisseriamacacae(猴奈瑟菌)，分值2.179；用Autof ms1000鑒定，結(jié)果為Neisseriamacacae(恒河猴奈瑟菌)，分值9.6。2種質(zhì)譜儀鑒定結(jié)果一致。

2.2.3靶向DNA測序鑒定 用16S rDNA基因測序鑒定方法：用細菌基因組DNA提取試劑盒DP320(Tiangen公司)提取分離菌株的基因組DNA作為PCR模板，采用27F(5′-AG

AGTTTGATCATGGCTC-3′)和1492R(5′-TAGGGTTACCTTGT

TACGACTT-3′)引物進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為：2×EasyTaq PCR SuperMix 15 μL，模板DNA 2.0 μL，10 μmol/L 27F引物1.0 μL，10 μmol/L 1492R引物1.0 μL，ddH2O補足體積至30 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，25個循環(huán)；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)12 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后，送北京睿博興公司進行16S rDNA測序，采用Illumina公司HiSeq 2500型測序儀，將序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST對比鑒定。結(jié)果顯示，分離株與恒河猴奈瑟菌、黏膜奈瑟菌的相似度均為99.654%：Neisseriamacacae(NR117701.1)99.645%，Neisseriamucosa(NR117696.1)99.645%。

3 藥敏試驗

因恒河猴奈瑟菌沒有可參考的藥敏試驗判斷折點，故參考CLSI M100第32版中表2I腦膜炎奈瑟菌抑菌圈直徑和MIC折點[3]。挑取純培養(yǎng)物配制為0.5 mol/L菌懸液，用棉簽蘸取均勻涂布于苛氧菌藥敏瓊脂平板(STM)上，在室溫放置10 min，將待測抗菌藥物的E-test條貼在平板上，然后放入35 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱溫育24 h后觀察MIC值。結(jié)果顯示，青霉素：4.0 μg/mL(R)、頭孢曲松：0.048 μg/mL(S)、美羅培南：0.048 μg/mL(S)、米諾環(huán)素：1.0 μg/mL(S)、環(huán)丙沙星：0.25 μg/mL(R)、左氧氟沙星：1.0 μg/mL(R)、復(fù)方磺胺甲噁唑：1.0 μg/mL(R)、氯霉素：4.0 μg/mL(I)、利福平：4.0 μg/mL(R)。其中，藥敏試驗平板和E-test條均來自于鄭州安圖生物公司。試驗中以ATCC 49619肺炎鏈球菌和ATCC 25922大腸埃希菌作為質(zhì)控菌株，所測E-test條MIC值均在質(zhì)控范圍內(nèi)。

4 結(jié)果與討論

直接涂片革蘭染色中觀察到，白細胞數(shù)量較多、在白細胞內(nèi)可見革蘭陰性雙球菌，以此判斷該菌為穿刺液中作為病原菌的依據(jù)。用實驗室現(xiàn)有的常規(guī)方法，如生物梅里埃API NH不能準確鑒定，因API系統(tǒng)中沒有相關(guān)的數(shù)據(jù)。用MALDI-TOF MS技術(shù)可準確鑒定。經(jīng)靶向DNA測序鑒定，與Neisseriamacacae(NR117701.1)序列相似度為99.645%，與Neisseriamucosa(NR117696.1)為99.645%。鑒定結(jié)果與黏膜奈瑟菌無法區(qū)別，這與臨床微生物學(xué)手冊中所描述的干燥奈瑟菌和恒河猴奈瑟菌被認為是黏膜奈瑟菌的變種[1]可能有關(guān)；恒河猴奈瑟菌和黏膜奈瑟菌對碳水化合物利用試驗均能利用葡萄糖、麥芽糖、果糖和蔗糖；但是黏膜奈瑟菌菌落較大、黏著、不產(chǎn)生色素，硝酸鹽還原試驗陽性；而恒河猴奈瑟菌的菌落與黏膜奈瑟菌菌落比較相對較小，光滑、濕潤、且有淡淡光亮的黃色素、隨著培養(yǎng)時間的延長其色素更加明顯、硝酸鹽還原試驗陰性。利用這些表型特征和生化試驗將兩者區(qū)別開來，以確定該菌為恒河猴奈瑟菌。

抗菌藥物敏感試驗應(yīng)該選擇MHA平板，因當時實驗室無MHA平板，考慮STM與MHA的基礎(chǔ)營養(yǎng)成分基本一致，故選擇用STM。根據(jù)藥敏結(jié)果，推薦使用頭孢曲松，該菌β-內(nèi)酰胺酶試驗陽性，而頭孢曲松對產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶菌株的腦膜炎奈瑟菌具有高度抗菌活性[4]，而恒河猴奈瑟菌屬于奈瑟菌屬，推測對其抗菌活性也強，另外消除半衰期長，具有長效作用。臨床治療中每日給予患者氯化鈉注射液+頭孢曲松鈉治療2周，效果顯著，病情穩(wěn)定后出院。

恒河猴奈瑟菌來自恒河猴的口咽部，這種動物源性奈瑟菌在咬傷人后可導(dǎo)致人傷口感染，該患者未與猴接觸過。據(jù)文獻報道，從人類標本中共分離出恒河猴奈瑟菌10例，其中血培養(yǎng)4例、腹膜透析液1例、口腔1例、咽試子1例、呼吸道3例[5]。而該菌引起膝關(guān)節(jié)的感染未見報道，而對引起以上感染的途徑及機制尚不清楚。恒河猴奈瑟菌是否也是人類上呼吸道的正常菌群，還或許是黏膜奈瑟菌的變種的這些疑惑，還需在今后的工作中求證。

MALDI-TOF MS能鑒定出用常規(guī)方法不能準確鑒定的少見菌和罕見菌。本例如果沒有直接涂片作為判斷病原菌的依據(jù)，有可能將恒河猴奈瑟菌當作污染菌。隨著鑒定手段的提高，通過涂片來溯源顯得尤為重要，只有判斷準確，再結(jié)合MALDI-TOF MS鑒定，才能在實際工作中發(fā)現(xiàn)這些少見菌和罕見菌引起的感染。