石夢瑤，張娜娜，王麟，彭沖，劉明軍，孫桂榮

(青島大學附屬醫(yī)院檢驗科，山東青島 266003)

肺癌是我國發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤，5年生存率低于20%。腫瘤局部的免疫反應和炎癥反應所形成的炎癥微環(huán)境是腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment, TME)的重要組成部分，促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移。有資料表明由免疫細胞及組織細胞分泌、在細胞間發(fā)揮相互調(diào)控作用的細胞因子參與了前列腺癌、乳腺癌及結(jié)直腸癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[1-3]。本研究通過檢測不同組織學分型、TNM分期和治療前后肺癌患者外周血細胞因子和炎性細胞的表達變化，探討其在肺癌發(fā)病中的參與作用及臨床意義。

1 材料和方法

1.1研究對象 選取2020年3月至2022年6月青島大學附屬醫(yī)院經(jīng)病理診斷確診、未經(jīng)任何抗腫瘤治療的肺癌患者458例，其中男250例，女208例，年齡(57.06±9.35)歲。按2015年版世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)肺腫瘤組織學分型標準[4]，分為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)組414例(其中腺癌363例、鱗狀細胞癌51例)及小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)組44例。按國際肺癌研究學會(The International Association for the Study of Lung Cancer, IASLC)第八版肺癌TNM分期標準[5]進行分期，包括肺腺癌組Ⅰ期217例、Ⅱ期50例、Ⅲ期58例、Ⅳ期38例；肺鱗癌組Ⅰ期11例、Ⅱ期12例、Ⅲ期17例、Ⅳ期11例，SCLC組Ⅰ期5例、Ⅱ期7例、Ⅲ期12例、Ⅳ期20例。全部入組病例均排除患支氣管和肺部其他疾病(包括上下呼吸道感染、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、間質(zhì)性肺疾病、支氣管擴張、肺結(jié)核等)、超敏反應、其他器官急性感染、自身免疫病、免疫缺陷病、外傷、急性心腦血管損傷、血液系統(tǒng)疾病，肝、腎功能不全、糖尿病以及其他組織器官惡性腫瘤等疾病。選取同期本院體檢健康人員44例作為健康人對照組，其中男25例，女19例，年齡(56.89±10.5)歲，體格檢查、實驗室檢驗、胸部影像學、B超等均未見異常，且與肺癌組患者比較，性別和年齡差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

本研究另對同期診于本院的87例初診的肺癌患者(肺腺癌Ⅲ期3例、Ⅳ期29例，肺鱗癌Ⅲ期12例、Ⅳ期8例，SCLC Ⅲ期17例、Ⅳ期18例)進行療效監(jiān)測，觀察這些患者經(jīng)一線化療4周期后血漿細胞因子和炎性細胞的變化。所有患者按實體瘤療效評價標準(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors，RECIST)V1.1[6]判定近期療效，并分為完全緩解(complete response，CR)、部分緩解(partial response，PR)、病情穩(wěn)定(stable disease，SD)和病情進展(progressive disease，PD)4種級別，并進一步分為兩大組，即疾病控制組(CR+PR+SD)和疾病進展組(PD)。本研究經(jīng)青島大學附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準(批準文號：QYFY WZLL 27257)，納入對象均知情同意。

1.2主要儀器與試劑 12項細胞因子檢測試劑盒(青島瑞思凱爾公司)，Navios流式細胞分析儀(美國Beckman Coulter公司)，XN-9000全自動血液分析儀及其配套試劑(日本Sysmex公司)。

1.3標本采集 用EDTA-K2抗凝采血管采集健康查體人員和肺癌患者治療前、后(經(jīng)4周期化療后)的清晨空腹靜脈血標本。1 000×g離心10 min，取分離出的血漿進行細胞因子檢測。全血充分混勻后在全自動血液分析儀上進行炎性細胞檢測。

1.4實驗室指標檢測

1.4.1血漿細胞因子檢測 血漿白細胞介素(interleukin, IL)-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、IL-12P70、干擾素(interferon, IFN)-α、IFN-γ、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α共12種細胞因子檢測采用多重微球流式免疫熒光發(fā)光法，按照細胞因子檢測試劑盒和Navios流式細胞分析儀說明書檢測。

1.4.2炎性細胞檢測 中性粒細胞計數(shù)(absolute neutrophil count, ANC)、淋巴細胞計數(shù)(absolute lymphocyte count, ALC)、單核細胞計數(shù)(absolute monocyte count, AMC)檢測采用熒光流式細胞技術(shù)，按照XN-9000全自動血液分析儀及其配套試劑說明書檢測，并經(jīng)計算獲得中性粒細胞計數(shù)與淋巴細胞計數(shù)比值(neutrophil-to-lymphocyte ratio, NLR)、單核細胞計數(shù)與淋巴細胞計數(shù)比值(monocyte-to-lymphocyte ratio, MLR)。

1.5統(tǒng)計學分析 用SPSS 26.0軟件進行。檢測數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布，用中位數(shù)(四分位數(shù))表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗，兩組間比較采用Mann-WhitenyU檢驗，治療前后比較采用Wilcoxon秩和檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1肺癌患者12種血漿細胞因子水平比較 經(jīng)非參數(shù)Kruskal-WallisH檢驗，對照組、SCLC組和NSCLC組3組間5種血漿細胞因子IL-2、IL-5、IL-6、IL-8和TNF-α水平差異均有統(tǒng)計學意義(H值分別為6.025、10.292、29.821、7.589、11.361，P均<0.05)，其余7種細胞因子水平差異無統(tǒng)計學意義；對差異有統(tǒng)計學意義的指標進行兩兩組間比較，結(jié)果表明，與對照組比較，SCLC組血漿IL-6、IL-8、TNF-α水平均明顯升高(U值分別為346、663、632，P均<0.05)，IL-2和IL-5水平無明顯變化，NSCLC組除血漿IL-6、IL-8、TNF-α水平明顯升高外，IL-5水平也明顯升高(U值依次分別為5 605.5、7 031、6 410.5和6 414.5，P均<0.05),而IL-2水平則明顯降低(U值為7 055，P<0.05)；與NSCLC組比較，血漿IL-6水平明顯升高(U值為6 491，P<0.01)，其余4種細胞因子水平無顯著變化；與肺腺癌組比較，肺鱗癌組血漿IL-2、IL-6水平明顯升高(U值分別為7 138、5 817.5，P均<0.01)，其余3種細胞因子水平無明顯變化。見表1。

表1 對照組、SCLC組和NSCLC組各血漿細胞因子水平比較[pg/mL，M(P25，P75)]

2.2肺癌患者3種炎性細胞及其比值NLR、MLR水平比較 經(jīng)非參數(shù)Kruskal-WallisH檢驗，對照組、SCLC組、NSCLC組3組間3種炎性細胞ANC、ALC、AMC和NLR、MLR水平差異均有統(tǒng)計學意義(H值分別為21.725、22.653、21.885、43.562、62.339，P均<0.001)。對差異有統(tǒng)計學意義的指標進行兩兩組間比較，結(jié)果表明，與對照組比較，SCLC組和NSCLC組ANC、AMC、NLR、MLR水平均明顯升高(SCLC組U值分別為481、466、302和223，NSCLC組U值分別為5 427、5 568、4 330和3 621，P均<0.001)，ALC水平均明顯降低(SCLC組U值為474，NSCLC組U值為6 096.5，P均<0.001)；與NSCLC組比較，SCLC組NLR、MLR水平明顯升高(U值分別為6 587.5和5 554，P均<0.01)，ALC水平則明顯降低(U值為666 1，P<0.01),ANC和AMC水平無明顯變化；與肺腺癌組比較，肺鱗癌組ANC、AMC、NLR、MLR水平明顯升高(U值分別為5 309.5、5 044.5、5 738和4 849，P均<0.001)，ALC水平則無顯著變化。見表2。

表2 肺癌組與對照組各炎性細胞水平比較[M(P25，P75)]

2.3不同TNM分期肺癌患者血漿細胞因子和炎性細胞水平變化 分析肺癌患者差異表達的5種血漿細胞因子IL-2、IL-5、IL-6、IL-8、TNF-α水平及3種炎性細胞ANC、ALC、AMC和NLR、MLR水平在不同TNM分期肺癌患者中的表達變化，結(jié)果見表3、表4。Mann-WhitneyU檢驗分析結(jié)果表明，SCLC組Ⅲ/Ⅳ期患者僅血漿IL-6水平明顯高于Ⅰ/Ⅱ期(U值為97.5，P<0.05)，其余4種細胞因子水平差異則無統(tǒng)計學意義；NSCLC組Ⅲ/Ⅳ期患者血漿IL-5、IL-6、IL-8水平明顯高于Ⅰ/Ⅱ期(U值分別為14 954.5、11 048、15 243，P均<0.05)，其余3種細胞因子水平無顯著變化，結(jié)果見表3。同時，SCLC組Ⅲ/Ⅳ期NLR、MLR明顯高于Ⅰ/Ⅱ期(U值分別為90、65，P均<0.01)，ALC則明顯低于Ⅰ/Ⅱ期(U值為96，P<0.05)，ANC、AMC水平差異則無統(tǒng)計學意義；NSCLC組Ⅲ/Ⅳ期患者ANC、AMC、NLR、MLR表達均高于Ⅰ/Ⅱ期(U值分別為12 237.5、14 370.5、12 617.5和14 245，P均<0.01)，ALC水平無明顯變化。

表3 不同TNM分期肺癌患者5種血漿細胞因子水平變化[pg/mL，M(P25，P75)]

表4 不同TNM分期肺癌患者炎性細胞水平變化[M(P25，P75)]

2.4不同療效晚期肺癌組患者化療前、后血漿IL-6、IL-8、TNF-α細胞因子水平及ANC、ALC、AMC、NLR、MLR炎性細胞水平變化 87例初診的肺癌患者經(jīng)一線化療4周期后血漿IL-6、IL-8、TNF-α及ANC、ALC、AMC、NLR、MLR水平變化見表5和表6，按RECIST實體瘤分級V1.1標準判定的近期療效評估結(jié)果為： CR患者0例，PR患者28例，SD患者34例，PD患者25例。疾病控制組(CR+PR+SD)和疾病進展組(PD)兩組在治療前血漿IL-6、IL-8、TNF-α水平差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。經(jīng)4周期治療后，疾病控制組血漿IL-6、IL-8、TNF-α水平較治療前明顯降低(P均<0.05)，而疾病進展組明顯升高(P均<0.05)，并且經(jīng)4周期治療后疾病進展組血漿IL-6、IL-8、TNF-α水平明顯高于疾病控制組(U值分別為441.5、415.5、372，P均<0.01)。同時，治療前兩組間ANC、ALC、AMC、NLR、MLR水平差異也均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，經(jīng)4周期治療后疾病控制組ANC、ALC、NLR水平明顯低于治療前(P均<0.05)，AMC、MLR水平則無明顯變化；疾病進展組治療后ANC、AMC、NLR、MLR水平均較治療前明顯升高，ALC水平則明顯降低(P均<0.05)，并且經(jīng)4周期治療后疾病進展組ANC、AMC、NLR、MLR水平明顯高于疾病控制組(U值分別為244.5、385.5、372，P均<0.001)，而ALC水平則明顯降低(U值為552.5，P<0.05)。

表5 不同療效晚期肺癌組患者化療前后血漿IL-6、IL-8、TNF-α水平變化[M(P25，P75)]

表6 不同療效晚期肺癌組患者化療前后ANC、ALC、AMC、NLR、MLR水平變化[M(P25，P75)]

3 討論

TME主要由腫瘤細胞和免疫細胞(中性粒細胞、單核/巨噬細胞、T/B淋巴細胞)以及其產(chǎn)生的細胞因子、趨化因子和生長因子等所構(gòu)成，彼此間相互作用，形成復雜的網(wǎng)絡，從而影響機體的免疫狀態(tài)[7-8]。細胞因子在機體免疫調(diào)節(jié)、宿主防御等機制中扮演重要角色，其中IL-6作為多效性細胞因子廣泛表達于單核/巨噬細胞、淋巴細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞中，IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-17主要由淋巴細胞分泌，IL-1β、IL-8、IL-12主要來源于單核/巨噬細胞，IFN-α、IFN-γ作為IFN家族成員代表主要由淋巴細胞、巨噬細胞等分泌[9]。本研究結(jié)果顯示，SCLC組、NSCLC組和對照組3組間血漿IL-2、IL-5、IL-6、IL-8和TNF-α水平差異顯著，其余7種細胞因子水平3組間比較則無明顯差異，預示前5種細胞因子可能是肺癌相關(guān)細胞因子。進一步分析發(fā)現(xiàn)，SCLC組僅血漿IL-6、IL-8、TNF-α 3種細胞因子水平發(fā)生變化，明顯高于對照組；NSCLC組血漿IL-5、IL-6、IL-8和TNF-α水平明顯高于對照組，IL-2水平明顯低于對照組，另見SCLC組血漿IL-6水平明顯高于NSCLC組，肺鱗癌組血漿IL-2和IL-6水平明顯高于肺腺癌組，這些結(jié)果均表明，血漿IL-2、IL-5和IL-6的表達因肺癌的組織病理學類型不同而異。IL-2作為Th1型細胞因子，在NSCLC患者表達受抑制可能與患者外周血Th1細胞數(shù)目減少有關(guān)。IL-5主要由Th2型細胞分泌，Th2型細胞介導的體液免疫抑制Th1型細胞介導的細胞免疫，使腫瘤細胞更易發(fā)生免疫逃逸[8]，Th1/Th2型細胞的失衡所致的Th1/Th2漂移可能與NSCLC發(fā)生發(fā)展的病理學機制有關(guān)。SCLC患者血漿IL-6水平和NSCLC患者血漿IL-5、IL-6、IL-8水平均隨肺癌分期的升高而升高，表明IL-5、IL-6、IL-8協(xié)同作用促進腫瘤細胞增殖。肺癌晚期患者經(jīng)4個周期系統(tǒng)化療后，病情控制組血漿IL-6、IL-8和TNF-α水平較治療前明顯降低，而病情進展組三者不僅沒有降低反而又進一步明顯升高，綜上表明，多種細胞因子參與了肺癌的疾病發(fā)生和發(fā)展。有資料表明IL-6廣泛表達于包括肺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中，通過與腫瘤浸潤免疫細胞表面IL-6受體結(jié)合，激活下游JAK/STAT3信號通路，誘導腫瘤促進因子、VEGF等的表達，參與腫瘤細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，也可直接作用于腫瘤細胞誘導其 STAT3 靶基因的表達，從而驅(qū)動腫瘤細胞的增殖和存活[2-3,10]。IL-8可通過自分泌和旁分泌的形式作用于肺癌細胞，主要通過IL-8通路或EGFR的反式激活發(fā)揮促肺癌細胞有絲分裂作用，以及通過CXCL8和VEGF協(xié)同作用促進內(nèi)皮細胞遷移和腫瘤血管生成[11-13]。腫瘤浸潤細胞刺激TME中的單核/巨噬細胞產(chǎn)生大量TNF-α，高表達的TNF-α激活TNF-α/TNFR2信號通路，上調(diào)的TNFR2通過激活NF-κB誘導多種激酶活化從而引起腫瘤生長[2，14]，同時TNF-α表達增加進一步促進巨噬細胞分泌IL-6，IL-6和TNF-α又可增加肺泡上皮細胞中VEGF的表達，促進腫瘤血管生成[13]。IL-2通過刺激T細胞、NK細胞和B細胞等效應細胞的表達發(fā)揮抗腫瘤作用[15]，腫瘤進展時，機體免疫系統(tǒng)失衡出現(xiàn)免疫抑制，IL-2表達受到抑制[8]，本研究也發(fā)現(xiàn)NSCLC組肺癌患者血漿IL-2水平明顯低于對照組，也可能是IL-2表達受到抑制所致。IL-5參與B細胞的分化及嗜酸性粒細胞的活化[9]，但關(guān)于IL-5在腫瘤生物學中的作用機制尚不明確。Hayama等[16]發(fā)現(xiàn)NSCLC患者惡性胸腔積液中IL-5過表達，且與惡性細胞數(shù)量相關(guān)，因此推斷IL-5在肺癌的發(fā)展、侵襲等過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)嗜酸性粒細胞增多與NSCLC的進展和不良預后相關(guān)[17]，由此可見其機制可能與IL-5促進嗜酸性粒細胞聚集相關(guān)，通過調(diào)節(jié)有利于腫瘤生長的TME促進腫瘤細胞增殖。

本研究有關(guān)外周血炎性細胞的研究結(jié)果顯示，SCLC組、NSCLC組和對照組3組間外周血ANC、ALC、AMC、NLR和MLR水平差異存在統(tǒng)計學意義，說明肺癌患者機體內(nèi)存在炎癥反應和免疫失衡。進一步分析發(fā)現(xiàn)，SCLC組和NSCLC組外周血ANC、AMC、NLR、MLR水平均明顯高于對照組，ALC水平明顯低于對照組。與NSCLC組比較，SCLC組NLR、MLR水平明顯升高，ALC水平明顯降低；另見肺鱗癌組ANC、AMC、NLR、MLR水平明顯高于肺腺癌組，以上結(jié)果均說明不同病理學分型肺癌患者的外周血炎性細胞的表達存在差異，提示TME中免疫細胞分布比例也可能存在差異。隨肺癌分期的升高，SCLC患者NLR、MLR水平升高，而ALC水平降低，NSCLC患者ANC、AMC、NLR、MLR水平均升高，表明炎性細胞在SCLC和NSCLC疾病進展中的參與機制不盡相同。SCLC進展主要與淋巴細胞免疫調(diào)節(jié)能力減弱相關(guān)，而NSCLC進展則與中性粒細胞、單核細胞發(fā)揮促腫瘤作用更密切，肺癌晚期患者經(jīng)4個周期系統(tǒng)化療后，病情控制組ANC、ALC、NLR水平較治療前明顯降低，而病情進展組ANC、AMC、NLR、MLR水平明顯升高，ALC水平明顯降低，進一步反映了肺癌的發(fā)生發(fā)展與炎癥反應密不可分。有資料表明淋巴細胞作為腫瘤免疫應答的核心，其中主要以T淋巴細胞介導的細胞毒作用和所釋放的細胞因子抑制腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移[8，17]；在腫瘤發(fā)生早期中性粒細胞在CXCL8等的刺激下活化并滲透到TME中形成腫瘤相關(guān)中性粒細胞(TANs)，TANs通過抑制免疫反應及產(chǎn)生炎癥因子、蛋白酶等衍生物來促進腫瘤細胞的運動和存活；外周血單核細胞是腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAMs)的主要來源，TAMs通過分泌促有絲分裂的相關(guān)因子促進腫瘤生長及增強免疫抑制作用，同時通過釋放VEGF等促進腫瘤血管生成和腫瘤細胞的侵襲[7，17-18]。

綜上所述，細胞因子IL-2、IL-5、IL-6、IL-8和TNF-α和炎性細胞ANC、ALC、AMC、NLR和MLR在不同組織學分型肺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了既相同又相異的作用，檢測外周血細胞因子和炎性細胞可以為肺癌的病理學分型、TNM分期和療效評估提供有價值的參考依據(jù)。