暴蓉，苗林子，哈斯朝魯，屈晨雪

(1.山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院檢驗科，太原030001；2.北京大學第一醫(yī)院檢驗科，北京100034)

膿毒癥是宿主對感染的反應失調(diào)引起的危及生命的多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)，可發(fā)展為嚴重膿毒癥和膿毒性休克。國內(nèi)研究顯示，我國重癥監(jiān)護病房(intensive care unit，ICU)患者中膿毒癥發(fā)病率約為20%，90 d病死率為35.5%[1]。近年來，專家學者對膿毒癥發(fā)病機制的探索也日趨完善，從局限到較為全面，共經(jīng)歷了3個階段。第一個階段，全身性炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)概念的提出，主要基于膿毒癥是一種感染誘導的全身炎癥反應的假設，但這一認知有較為明顯的局限性，只關注到了膿毒癥始動因素，即感染所致全身炎癥，缺乏對膿毒癥其他相關和后續(xù)病程的了解，這也導致了診斷特異性低，不利于臨床診斷和研究；第二個階段，主要改進是在全身炎癥反應之外，關注了相關血液動力學、組織灌注和器官功能狀態(tài)，但這一認知同樣也存在局限性，即對膿毒癥的概念仍然停留在臨床癥狀階段，對其深層次發(fā)病機理的研究仍然較為缺乏，無助于提高膿毒癥的診斷和治療效率，同時其復雜性也難以在臨床廣泛應用；第三個階段即現(xiàn)階段，從免疫學角度闡述了膿毒癥的發(fā)病機理，認為其本質(zhì)上是嚴重感染所致的免疫紊亂，包括過度免疫激活和免疫抑制2個關鍵因素[2]，最終導致患者發(fā)生MODS甚至死亡。而且有研究指出，即使是膿毒癥幸存者，也存在長期的身體和認知障礙，其死亡率高于一般人群。具體來說，膿毒癥幸存者在出院后的第一年內(nèi)死亡率為15%，在未來5年內(nèi)每年死亡率為6%～8%[3]。因此，從根本上逆轉(zhuǎn)導致膿毒癥患者高死亡率的免疫抑制，成為治療膿毒癥極具創(chuàng)新性和實用性的研究方向，同時還可作為免疫治療效果評估的重要途徑[4]。本文將圍繞膿毒癥患者的發(fā)病機制即免疫功能紊亂，免疫功能評價指標即流式細胞儀檢測T、B淋巴細胞數(shù)量和功能及細胞因子，和臨床治療中的免疫增強與抗炎3個方面來展開論述，期望為臨床醫(yī)生提供治療膿毒癥的免疫學思路和方法。

1 膿毒癥患者免疫功能及其紊亂

膿毒癥常常表現(xiàn)為大量炎癥因子的增加和同時存在的淋巴細胞數(shù)量和功能的降低，其病理過程稱之為持續(xù)的炎癥反應和持續(xù)的免疫抑制。

1.1炎癥反應的循環(huán)往復 在大多數(shù)情況下，機體免疫功能正常。當有外源性微生物侵入機體或機體發(fā)生內(nèi)源性損傷時，會有對應的2類“警報素”，外源性微生物產(chǎn)物病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)和內(nèi)源性組織損傷來源的損傷相關分子模式(damage associated molecular patterns, DAMPs)，向機體釋放，二者是體內(nèi)模式識別受體(pattem recognition receptors, PRRs)的配體[5]，引起炎癥反應，用于消除體內(nèi)“異己”，抗炎和促炎處于動態(tài)平衡。但是在發(fā)生膿毒癥時，機體固有免疫和適應性免疫都不同程度出現(xiàn)了細胞數(shù)量減少和免疫功能下降的特征，例如中性粒細胞遷移能力減弱，樹突狀細胞數(shù)量減少和抗原提呈能力下降，誘導T細胞免疫應答能力減弱等，這些因素共同導致了外來病原體清除能力下降，病原菌不能被完全清除，持續(xù)低水平向體內(nèi)釋放“警報素”，接連不斷的外來刺激又使M1型巨噬細胞釋放過量的促炎細胞因子，如IL家族成員(IL-1、IL-3、IL-6、IL-8等)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和IFN-γ，進一步加重了免疫損傷。如此最終導致炎癥誘導的器官損傷和損傷誘導的炎癥的持續(xù)惡性循環(huán)，患者病情持續(xù)加重，死亡率增加。慢性炎癥所致的器官損傷主要通過誘導線粒體中活性氧產(chǎn)生增加[6]，這種氧化應激導致線粒體功能障礙、氧化損傷和細胞代謝能量不足，進一步加重炎癥和細胞死亡。炎癥導致的腎臟和肌肉損傷則導致這些組織中進一步釋放內(nèi)源性DAMPs，機體進入下一個炎癥循環(huán)[7]。膿毒癥患者長期處于炎癥狀態(tài)，免疫細胞和免疫組織消耗殆盡，機體免疫功能嚴重紊亂，免疫反應進入抑制階段。

1.2多因素所致的免疫抑制

1.2.1免疫細胞數(shù)量減少 持續(xù)存在的炎癥反應使免疫細胞損耗增加，同時膿毒癥本身也會發(fā)生骨髓抑制現(xiàn)象，使免疫細胞數(shù)量減少，主要表現(xiàn)為急性淋巴細胞數(shù)量減少，淋巴細胞計數(shù)持續(xù)低于1.0×109/L，高度提示患者免疫抑制狀態(tài)，預后不良[8]。樹突狀細胞、NK細胞和T細胞在免疫紊亂過程中都表現(xiàn)為對抗原刺激呈持續(xù)低反應狀態(tài)[9]。

1.2.2免疫細胞功能異常 除樹突狀細胞抗原提呈能力下降，單核/巨噬細胞和T淋巴細胞也有不同程度的功能改變。單核細胞活化標志膜HLA-DR(mHLA-DR)表達減少，導致刺激T細胞和B細胞完全活化的共刺激信號減弱；單核/巨噬細胞釋放的促炎因子如TNF-α和IL-12明顯減少，發(fā)揮免疫抑制作用的抗炎因子IL-10明顯增多。Th細胞分化為Th2型明顯增多，Th2細胞分泌抑制性細胞因子IL-4、IL-13和IL-10，抑制巨噬細胞和白細胞的活化和增殖，抑制炎癥反應，免疫功能表現(xiàn)為抑制狀態(tài)，Th1/Th2比例失調(diào)的嚴重程度與疾病的預后相關[10]。Treg異常升高伴隨Th17/Treg比例倒置，也提示免疫抑制發(fā)生。Th17細胞主要產(chǎn)生IL-17、IL-6和IL-22，募集、激活和趨化中性粒細胞至炎癥感染部位，消除病原體并介導炎癥反應；Treg細胞促進T細胞凋亡，發(fā)揮免疫抑制作用。

1.2.3抑制性免疫檢查點表達增強 抑制性免疫檢查點為近年來腫瘤免疫治療的熱點，拮抗抑制性免疫檢查點，提升患者免疫功能，增強機體抗腫瘤、抗感染的能力，也日漸在膿毒癥治療方面受到關注，為解決膿毒癥患者的免疫抑制甚至“免疫癱瘓”提供了新的思路。抑制性免疫檢查點是白細胞表面特定的檢查點蛋白，包括程序性細胞死亡受體1(programmed death receptor-1, PD-1)、程序性細胞死亡受體配體1(programmed cell death-ligand 1, PD-L1)、程序性細胞死亡受體配體2(programmed cell death-ligand 2, PD-L2)、細胞毒性T淋巴細胞抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4)、B和T淋巴細胞衰減因子(B- and T-lymphocyte attenuator, BTLA)、淋巴細胞激活基因-3(lymphocyte-activation gene 3，LAG-3)和T淋巴細胞免疫球蛋白黏蛋白3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3, TIM-3)和2B4，其主要作用是限制免疫系統(tǒng)過度激活和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。免疫檢查點受體主要位于T淋巴細胞上，通過識別抗原提呈細胞(antigen presenting cells，APCs)如單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞上的互補配體來發(fā)揮作用。膿毒癥患者T淋巴細胞上免疫檢查點受體表達增加，通過抑制白細胞殺菌功能來促進敗血癥誘導的免疫抑制[11]。封鎖免疫檢查點的治療方法在逆轉(zhuǎn)膿毒癥誘導的免疫抑制和保持機體免疫力，對抗原發(fā)性和繼發(fā)性感染方面具有顯著作用[3]。下面是常見抑制性免疫檢查點在膿毒癥中的運用。

1.2.3.1PD-1和PD-L1/PD-L2 膿毒癥時PD-1在T細胞上表達增加，兩者相互作用產(chǎn)生抑制信號來減弱T細胞的反應，導致T細胞耗竭[12]。T淋巴細胞在體內(nèi)發(fā)揮重要的細胞免疫作用，T細胞耗竭與病原體清除受損、多器官損傷和死亡率增加有關。PD-1/PD-L1除了損害淋巴細胞，對髓細胞也有抑制作用。在膿毒癥患者中，中性粒細胞和單核細胞上PD-L1表達的增加與其吞噬能力的下降相關，膿毒癥休克恢復期(第7天)患者PD-1表達恢復正常[13]。

1.2.3.2CTLA-4和CD80/CD86 膿毒癥患者的T細胞上CTLA-4(CD152)的表達呈時間依賴性的進行性增加，CTLA-4信號可加強APCs的內(nèi)吞作用，使CD80和CD86在APCs細胞表面表達減少，由于CD80和CD8同時是介導T細胞激活的共刺激受體CD28的配體，所以CTLA-4是T細胞效應功能的負性調(diào)控因子，而且其增加也與T細胞的凋亡增加有關[14]。最近有研究指出，特異性CTLA-4單核苷酸多態(tài)性的存在可能有利于緩解CTLA-4介導的T細胞衰竭，例如CTLA-4基因中存在rs3087243 G等位基因的膿毒癥患者，其28 d和90 d死亡風險較低[15],這一發(fā)現(xiàn)也從基因水平揭示了膿毒癥發(fā)病機制的異質(zhì)性。

1.2.3.3BTLA和皰疹病毒侵入介質(zhì)(herpesvirus entry mediator，HVEM) BTLA(CD272)和HVEM的結合主要抑制TCR信號介導的效應功能，包括T細胞的激活和增殖[16]。膿毒癥時，靶向BTLA可以同時激活固有免疫和適應性免疫[3]。同時可溶性BTLA(sBTLA)也是膿毒癥較好的預后標志物，血漿中sBTLA水平高于21 ng/mL，預示著膿毒癥患者的死亡率增加5倍[17]，需要注意的是運用抗BTLA抗體應密切關注使用劑量和使用時間。

1.2.3.42B4/CD48 CD48表達在APC上，是已知2B4(CD244)的配體。2B4特異性介導記憶T細胞的丟失，而2B4的缺失可減弱記憶T細胞的丟失，從而提高膿毒癥患者的生存率[18]，同時敲除2B4還可以防止膿毒癥誘導的抗原特異性CD8+T細胞的丟失，并減輕膿毒癥后增加的病毒載量，同時使PD-1表達也降低[19]?？梢娮钄?B4通路可同時阻斷其他一些共抑制受體，保存T淋巴細胞的功能。

2 膿毒癥患者免疫功能的檢測

2.1流式細胞儀的臨床運用 從多色流式細胞術到光譜流式細胞術，流式細胞術的發(fā)展具備了更好的清晰度和更多色的熒光素，是臨床工作中首選的單個細胞分析技術[20]。流式細胞術的運行效率達到每秒10萬事件，通過免疫學原理結合被分析細胞的標記特征(如表面抗原、胞漿抗原、核抗原和DNA)，可從成千上萬個細胞中快速識別異常細胞，量化特定細胞的增多或減少，為監(jiān)測患者病情變化提供動態(tài)監(jiān)測指標。流式細胞儀跟蹤特定細胞數(shù)量的變化，可為臨床輔助診斷相關癌癥(如白血病的免疫分型)、炎癥(炎癥因子的釋放)或免疫抑制(淋巴細胞的數(shù)量和功能)及各種綜合征(如陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿)提供參考。流式細胞技術在我國已廣泛應用于血液學、免疫學、腫瘤及細胞治療等多個領域，在評價免疫功能方面，流式細胞術也取得了顯著的成效。目前，流式細胞儀檢測淋巴細胞亞群和細胞因子，在臨床得到了廣泛的開展與認可。其一，通過動態(tài)監(jiān)測T淋巴細胞、B淋巴細胞和NK淋巴細胞的數(shù)量變化，可初步掌握患者的全身免疫功能狀態(tài)；其二，由于T淋巴細胞在體內(nèi)主要執(zhí)行細胞免疫的功能，其中CD4+T細胞為輔助性T細胞，CD8+T細胞為殺傷性T細胞，當CD4+/CD8+比值降低時，提示患者發(fā)生感染的風險增加，預后不良；其三，不同的細胞因子在體內(nèi)分別發(fā)揮促炎和抗炎的作用，通過檢測促炎因子(如TNF-α、IL-6和IL-8)和抗炎因子(如IL-4、IL-10和IL-13)的含量，有效避免膿毒癥患者免疫抑制的發(fā)生。

2.2免疫功能檢測指標 除臨床普遍開展的淋巴細胞亞群即T淋巴細胞、B淋巴細胞和NK淋巴細胞的檢測，在流式細胞儀上通過增加熒光抗體，還可將T淋巴細胞和B淋巴細胞細分為25個亞類。具體檢測指標包括T淋巴細胞亞類：CD4+T細胞、純真CD4+T細胞、中央記憶CD4+T細胞、效應記憶CD4+T細胞、效應CD4+T細胞、CD8+T細胞、純真CD8+T細胞、中央記憶CD8+T細胞、效應記憶CD8+T細胞、效應CD8+T細胞、CD8+/CD28+、CD8+/CD28-、CD4+/HLA-DR+、CD8+/HLA-DR+、Th1、Th2、Th9、Th17、Treg；B淋巴細胞亞類：漿母細胞、漿細胞、過渡B細胞、純真B細胞、類別B細胞、未類別B細胞。同時細胞因子的檢測也發(fā)揮了重要的作用，包括IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-α、IFN-α2和IFN-γ。流式細胞儀檢測細胞因子為臨床評價體內(nèi)炎癥和免疫狀態(tài)提供了有效手段，檢測原理是基于免疫學的“夾心法”[21]，即熒光微球偶聯(lián)的細胞因子抗體與生物素標記的因子抗體配體和標本中的細胞因子結合形成“夾心”，在熒光素的標記下進行檢測。膿毒癥具有炎癥因子風暴和免疫抑制的特點，膿毒癥患者中IL-1β水平死亡組明顯高于存活組[22]；IL-2大量分泌將激活3種主要的信號通路，包括JAK-STAT通路、RAS-MAP激酶通路和PI3/AKT通路，導致免疫反應失控[23]；IL-6增加血管通透性，利于炎癥擴散，膿毒癥幸存者中含量明顯下降，而在死亡組則維持較高的水平[24]；大量炎癥因子釋放過后，抑制性抗炎因子又在體內(nèi)持續(xù)增高，嚴重影響機體免疫功能的恢復，導致膿毒癥患者免疫功能失調(diào)、多臟器損傷甚至死亡。

3 基于膿毒癥患者免疫功能紊亂的免疫學干預策略

目前，膿毒癥的治療主要采用的是抗菌藥物、液體置換和器官支持性治療等，但都存在著一些弊端，治療效果也不盡如人意。例如抗菌藥物的耐藥現(xiàn)象愈演愈烈和器官支持性治療只能降低膿毒癥患者在院死亡率，出院后1年內(nèi)死亡率仍然居高不下。針對自身免疫抑制和持續(xù)不斷的炎癥刺激，運用免疫激活劑和炎癥抑制劑促使膿毒癥患者免疫功能恢復，將是膿毒癥未來治療關注的重點。

3.1促進免疫細胞的增殖和分化

3.1.1粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF) GM-CSF是一種造血刺激因子，可刺激多種免疫細胞的增殖和分化，誘導髓系干細胞分化成為成熟粒細胞，增強中性粒細胞和單核巨噬細胞的吞噬作用和抗菌活性[25]，提高免疫細胞功能，上調(diào)mHLA-DR表達。以WBC或mHLA-DR為導向的GM-CSF的治療可能改善膿毒癥患者的預后，但劑量和療程需得到更多的研究驗證[26]。

3.1.2IL-7 IL-7在骨髓和胸腺中產(chǎn)生，為T細胞成熟和存活所必需。IL-7可以減少淋巴細胞凋亡，誘導T細胞增殖，增加IFN-γ、抗PD-L1抗體、粒細胞集落刺激因子和GM-CSF等，促進白細胞向感染部位遷移，提高存活率[27]，重組人IL-7(CYT107)在增加淋巴細胞數(shù)量的同時還不會導致過度的炎癥反應和器官功能損害，可有效調(diào)理免疫抑制[28]。

3.1.3胸腺肽α1(thymosin α1, Tα1) Tα1是一種由胸腺等器官分泌的內(nèi)源性肽，是一種天然的小分子物質(zhì)，可以激活樹突狀細胞，提高NK細胞活性，直接增強巨噬細胞介導的吞噬和抗菌作用，上調(diào)單核細胞活化標志HLA-DR和抑制PD-L1表達，達到協(xié)同增強免疫功能的目的，同時還可增加T細胞數(shù)量和活性，主要增強Th1細胞的抗菌活性[29]。

3.1.4抗PD-L1抗體/PD-1抗體 阻斷PD-1/PD-L1通路，恢復T細胞功能，在腫瘤免疫治療中已取得了一定成果。鑒于膿毒癥和腫瘤在免疫抑制方面的相似性，目前也有實驗表明，膿毒癥患者淋巴細胞計數(shù)小于1.0×109/L，即處于免疫抑制狀態(tài)時，運用抗PD-L1抗體和抗PD-1抗體高劑量治療(300～900 mg)，可顯著上調(diào)單核細胞的HLA-DR，并維持增加超過28 d，與此同時促炎細胞因子(如IL-6、IL-8或IL-10)的水平并沒有升高[30]，其有效性和安全性得到初步的證實。

3.2抑制體內(nèi)炎癥反應的過度發(fā)生 從膿毒癥的發(fā)病機制來看，注重恢復患者免疫功能的同時，抑制持續(xù)的炎癥反應也是另一種重要的治療途徑。糖皮質(zhì)激素通過下調(diào)控制炎癥反應發(fā)生的基因(包括NF-κB和AP-1)來達到抑制固有免疫反應的目的[31]。氫化可的松聯(lián)合氟氫可的松可降低膿毒癥患者90 d死亡率[32]。在近期一項對新型冠狀病毒肺炎重癥患者治療的研究中發(fā)現(xiàn)，抗IL-6受體抗體(托珠單抗)可結合膜或可溶性IL-6受體，達到阻斷下游炎癥信號轉(zhuǎn)導，改善預后的目的[33]，同時聯(lián)合糖皮質(zhì)激素，將得到更大的益處[34]。但是使用細胞因子拮抗劑要注意時間節(jié)點，在感染的早期階段炎癥因子可以促進免疫功能的正常發(fā)揮，起到控制感染的作用，只有炎癥反應失調(diào)持續(xù)存在并出現(xiàn)損傷時使用，可以抑制持續(xù)的免疫反應。烏司他丁作為體內(nèi)天然的抗炎物質(zhì)，可抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放，增加抗炎因子IL-10水平[35]，促進促炎反應和抗炎反應之間的平衡，從而阻斷炎癥反應惡性循環(huán)導致的細胞因子風暴，保護血管內(nèi)皮，可用于治療膿毒癥相關的急性循環(huán)衰竭，聯(lián)合Tα1可縮短機械通氣持續(xù)時間，改進28 d生存率[36]。高劑量的烏司他丁具有與糖皮質(zhì)激素相同的抗炎作用，但不會產(chǎn)生免疫抑制，具有比糖皮質(zhì)激素更小的副作用。

4 結論

膿毒癥患者免疫功能狀態(tài)直接影響臨床治療措施和患者的預后。因此，動態(tài)監(jiān)測膿毒癥患者的免疫功能變化，重點關注免疫細胞數(shù)量和功能的改變及細胞因子的釋放，發(fā)現(xiàn)更為有效和便捷的免疫功能預測標志物，及時采取有效的治療措施，通過免疫治療提高免疫細胞數(shù)量和改善免疫系統(tǒng)功能，同時聯(lián)合抗炎抗感染、液體置換和器官支持治療，將會給膿毒癥患者帶來新的治療希望。