劉婉 趙珊珊 焦湞 楊逢源 王雁萍

（鄭州大學(xué)物理工程學(xué)院，鄭州 450000）

纖維素是地球上豐富的可再生資源，纖維素類物質(zhì)的利用對解決全球性的能源危機具有十分重要的意義。我國是個農(nóng)業(yè)大國，秸稈總產(chǎn)量居世界首位，每年產(chǎn)生約8×107t以上秸稈［1］。當(dāng)前秸稈的利用方式主要有秸稈還田、秸稈作飼料、秸稈栽培食用菌、秸稈作能源和秸稈作工業(yè)原料，但是仍然存在秸稈利用率低、秸稈作為能源轉(zhuǎn)化效率低等問題［2］。

纖維素酶是由多種可降解纖維素生成葡萄糖的水解酶組成的復(fù)雜酶系，因此定義為纖維素酶系。根據(jù)纖維素酶組分在降解纖維素過程中作用的不同，將纖維素酶分為3類，分別為內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶［3］。自然界中存在著大量的能產(chǎn)生纖維素酶的菌株，因此從中篩選產(chǎn)纖維素酶較高的菌株在纖維素的高效利用領(lǐng)域具有十分重要的意義。目前常見的產(chǎn)纖維素酶菌株主要有真菌、細(xì)菌和放線菌。由于真菌產(chǎn)纖維素酶具有酶系全，產(chǎn)量高等優(yōu)點，因此對真菌產(chǎn)纖維素酶的研究最多。但真菌產(chǎn)纖維素酶也存在著培養(yǎng)周期長的缺點，而細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶的培養(yǎng)周期較短。因此，研究細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶或者改良細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶菌株具有十分重要的現(xiàn)實意義。

目前，國內(nèi)DNS測纖維素酶活法多使用分光光度計來測量吸光值，且反應(yīng)體系都在試管中進(jìn)行。測量過程步驟復(fù)雜，耗時時間長、粗酶液樣品需求量大，不利于大批量樣品快速檢測酶活。本實驗采用Kim［4］改良后的DNS測酶活法即酶標(biāo)儀高通量測酶活法，可提高篩選效率，且實驗結(jié)果更直觀，將此法應(yīng)用于離子束誘變初篩實驗中，以期高效快速篩選出高產(chǎn)CMC酶活的突變菌株。

近年來，離子束在改良生物材料方面的應(yīng)用與發(fā)展十分迅速。離子束具有損傷輕、突變率高、突變譜廣、誘變育種技術(shù)穩(wěn)定可靠、簡便易行、重復(fù)性好等優(yōu)點，且誘變效應(yīng)是局部、可選擇、可控的［5］。本研究從含腐敗秸稈的土壤中分離纖維素酶產(chǎn)生菌，并采用離子束誘變法輻照出發(fā)菌株，以期提高出發(fā)菌株產(chǎn)CMC酶活的能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 樣品采自含腐敗秸稈的土壤。

1.1.2 培養(yǎng)基 CMC-Na初篩培養(yǎng)基（g/L）：CMCNa 10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO40.2 g/L，酵母粉10.0 g/L，瓊脂18.0 g/L，pH 7.0；CMCNa生長培養(yǎng)基（g/L）：CMC-Na 10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO40.2 g/L，酵母膏10.0 g/L，瓊脂18.0 g/L，pH 5.0；產(chǎn)酶培養(yǎng)基（g/L）：CMC-Na 15.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO40.2 g/L，酵母膏10.0 g/L，pH 5.0。

1.1.3 試劑配制方法 3，5-二硝基水楊酸試劑（DNS）配置方法：酒石酸鉀鈉182.0 g，溶于500 mL蒸餾水中，加熱（不超過50℃），于熱溶液中依次加入3，5-二硝基水楊酸6.3 g、NaOH 21.0 g、苯酚5.0 g、無水亞硫酸鈉5.0 g，攪拌至完全溶解，冷卻后用蒸餾水定容至1 000 mL，貯于棕色瓶中，避光室溫保存兩周后使用［6］。

剛果紅試劑：剛果紅1 g/L。亞甲基藍(lán)染色劑：亞甲基藍(lán)1 g/L。

1.1.4 儀器設(shè)備 ZHP-230落地冷凍搖床：常州普天儀器制造公司；YXQ-LS-SOSII型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；離心機AllegraTM64R Centrifuge：BECKMAN COULTER；PH計：Seven Excellence，Switzerland；酶標(biāo)儀VARIOSKAN LUX ：Thwemo。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集 將收集到的土樣與無菌水充分混合，過濾去除殘渣。收集樣品過濾后的濾液，取適量濾液上清液進(jìn)行梯度稀釋，將稀釋液涂在CMCNa初篩培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)，出現(xiàn)菌落后反復(fù)劃線、純化培養(yǎng)，獲得純菌落。

1.2.2 產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選 將純化后的菌落分別點種在CMC-Na初篩培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)基點3個樣，30℃培養(yǎng)3 d，用1 g/L 剛果紅染液染色20 min，棄去染液，加入1 mol/L NaCl 溶液，洗滌5 min后棄去NaCl 溶液，測量菌落直徑和透明圈直徑，分別用D和H來表示。根據(jù)透明水解圈直徑和菌落直徑的比值（D/H）大小初步判斷菌株產(chǎn)纖維素酶的能力，選取比值大的菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2.3 菌種鑒定 將出發(fā)菌株進(jìn)行分子鑒定，取搖瓶180 r/min，培養(yǎng)3 d的菌液離心，提取DNA。以所提取的DNA為模版，使用細(xì)菌的通用引物27F和1492R進(jìn)行16S rRNA基因的PCR擴增。擴增體系為 50 μL（10×Buffer 5.0 μL，MgCl23.0 μL，dNTPs 4.0 μL，引物各 1.5 μL，Taq 酶 0.4 μL，DNA 模板 1.0μL，ddH2O 33.6 μL）。PCR 條件 ：95℃ 5 min ；94℃40 s，55.3℃ 40 s，72℃ 90 s，72℃ 5 min ；共 32 個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物測序由武漢華大基因科技公司完成。將測序得到的序列，通過NCBI進(jìn)行BLAST比對與已知16S rRNA序列進(jìn)行同源性的比較，并用Mega軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.4 離子束誘變 將出發(fā)菌株在CMC-Na生長培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)2 d。用接種環(huán)挑取適當(dāng)菌體到4mL的誘變保護(hù)劑中，并用震蕩器使菌體在誘變保護(hù)劑中均勻分布制成菌懸液，然后測量菌懸液的OD600值。適當(dāng)加入菌體或誘變保護(hù)劑使菌懸液的OD600在0.5-0.8之間，以保證輻照過程中，菌體單層平鋪于培養(yǎng)皿中。取50 μL菌懸液在培養(yǎng)皿中央均勻涂布，涂布形成直徑為2 cm的圓形區(qū)域，在超凈工作臺中自然晾干。N+注入劑量分別為1×1014N+/cm2、5×1014N+/cm2、1×1015N+/cm2、5×1015N+/cm2、1×1016N+/cm2和5×1016N+/cm2，此誘變劑量的選擇參照離子束誘變細(xì)菌的劑量［7］。輻照后在培養(yǎng)皿中加入4 mL無菌水，并用滅菌后的橡膠塊擦拭培養(yǎng)皿底部輻照過的菌斑。最后將菌液倒入含30 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基的錐形瓶中，在37℃，160 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)12 h。

1.2.5 誘變致死率與正負(fù)突變率的測定方法 將誘變前的菌懸液梯度稀釋涂布于CMC-Na生長培養(yǎng)基上。培養(yǎng)48 h后計數(shù)得出誘變前菌液濃度。將誘變過后橡膠塊擦拭完全的菌液震蕩均勻后，稀釋涂布于CMC-Na生長培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48 h后計數(shù)得出誘變后菌液濃度。在測定正突變率時，將突變菌株中CMC酶活高于出發(fā)菌株的突變菌株定義為正突變菌株。

1.2.6 誘變前后菌株的形態(tài)特征 用接種環(huán)點種出發(fā)菌株與突變菌株在CMC-Na生長培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)96 h后，觀察單菌落形態(tài)特征。同時用亞甲基藍(lán)試劑對菌體進(jìn)行染色，并在1 000倍顯微鏡下進(jìn)行鏡檢。

1.2.7 突變菌株的初篩和復(fù)篩 初篩：輻照后的菌株在CMC-Na液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中37℃，160 r/min 搖床培養(yǎng)12 h后，稀釋涂布于CMC-Na生長培養(yǎng)基上。30℃培養(yǎng)48 h后，從平板上挑取單菌落進(jìn)行編號，通過畫線擴大培養(yǎng)。將培養(yǎng)好的菌株用無菌槍頭或牙簽接種至裝有2 mL CMC-Na產(chǎn)酶培養(yǎng)基的試管中。放入37℃，180 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h后，酶標(biāo)儀測其酶活。復(fù)篩：將初篩CMC酶活較高的突變菌株挑出，傳代培養(yǎng)5代后。每個突變菌株以5%的接種量，在37℃，180 r/min搖床培養(yǎng)24 h后，測其CMC酶活。

1.2.8 CMC酶活測定法 本實驗所測CMC酶活為內(nèi)切葡聚糖酶活，CMC酶活測定采用酶標(biāo)儀高通量測定法。測定樣品如圖1所示。

取待測粗酶液20 μL于96孔板中，加入20 μL 1%的羧甲基纖維素鈉溶液（pH為5.0的磷酸緩沖液配置）。40℃水浴反應(yīng)30 min，然后加人160 μL DNS試劑，用鋁箔包好96孔板，防止揮發(fā)，放入120℃的鼓風(fēng)干燥箱中烘烤20 min，然后用酶標(biāo)儀在540 nm波長下測定光吸收值，并從葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算得出相對應(yīng)的葡萄糖含量，進(jìn)而計算酶活［4］。

圖1 菌株DNS顯色圖

酶活力定義為：在適當(dāng)?shù)臏囟群蚿H值條件下，每1 min內(nèi)1 mL酶液水解相應(yīng)的底物轉(zhuǎn)化成1 μg還原糖的酶量定義為1個酶活力單位（U）。

2 結(jié)果

2.1 菌株的篩選與鑒定

從含腐敗秸稈的土壤中分離出7株纖維素酶產(chǎn)生菌，它們的透明圈直徑（D）、菌落直徑（H）、D/H，以及培養(yǎng)24 h后CMC酶活的測定結(jié)果，如表1所示。其中S-1的D/H比值為2.33，CMC酶活為6.88 U/mL，S-1表現(xiàn)出較高的產(chǎn)纖維素酶的能力。S-1在初篩培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)及剛果紅染色后形成的透明圈如圖2所示。

根據(jù)出發(fā)菌株S-1的16S rRNA的序列，選擇同源性較高的菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示。結(jié)合理化特征，將菌株S-1鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

表1 篩選菌株的D/H與CMC酶活

圖2 菌株S-1剛果紅染色后形成透明圈圖

圖3 基于16S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 誘變致死率

選擇CMC酶活較高的S-1作為出發(fā)菌株，進(jìn)行離子束誘變，誘變劑量的選擇參照離子束誘變細(xì)菌的劑量，離子束誘變在6個不同N+注入劑量下的誘變致死率，見表2。隨著劑量的增加，致死率基本呈升高趨勢。當(dāng)劑量在（5×1014-5×1015）N+/cm2之間時，誘變致死率基本維持在70%-85%左右，正突變率均在28%以上。在劑量為5×1014N+/cm2時，正突變率最高為44%。在劑量為1×1016N+/cm2與5×1016N+/cm2時，致死率較高，正突變率較低。因此，在篩選突變菌株過程中盡可能多選輻照劑量在（1×1014-1×1016）N+/cm2之間的突變菌株。

表2 出發(fā)菌株S-1在不同劑量下的誘變致死率和正突變率

2.3 突變菌株的形態(tài)學(xué)差距

在離子束誘變后的單菌落傳代培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)有部分菌株菌落形態(tài)發(fā)生變化，如突變菌株308。如圖4所示，出發(fā)菌株S-1單菌落呈白色，圓形，中央突起，不透明，突變菌株308單菌落呈乳白色，圓形，表面粗糙，有皺褶，中央突起，邊緣透明。突變菌株308與出發(fā)菌株S-1相比形成的單菌落較小。將出發(fā)菌株S-1與突變菌株308用亞甲基藍(lán)溶液染色后在1 000倍顯微鏡下進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)突變菌株308的芽孢形態(tài)發(fā)生變化。出發(fā)菌株S-1的芽孢呈橢圓形，而誘變菌株308的芽孢呈圓形。低能N+注入前后突變菌株形態(tài)學(xué)差異較大，這種變化表示離子束誘變可能導(dǎo)致出發(fā)菌株S-1內(nèi)部基因序列發(fā)生改變。

2.4 突變菌株的篩選與遺傳穩(wěn)定性驗證

低能N+注入后，挑取400株誘變后菌株，選取酶活較高的15株突變菌株傳代培養(yǎng)5代后，其CMC酶活數(shù)據(jù)見表3。如表3所示，15株突變菌株的CMC酶活與出發(fā)菌株S-1的CMC酶活相比均有升高。其中CMC酶活增長率在1%-25%的有8株菌，CMC酶活增長率在25%-50%的有5株菌，CMC酶活增長率在50%-75%的有1株菌，CMC酶活增長率大于75-1相比，CMC酶活增長極顯著，增長率達(dá)到了84.40%。將突變菌株308繼續(xù)傳代培養(yǎng)，突變菌株308與出發(fā)菌株S-1在第6、8、10代的CMC酶活見圖5。突變菌株308的CMC酶活在第6、8、10代均保持穩(wěn)定，基本維持在16.0-17.5 U/mL左右。因此，可認(rèn)為離子束誘變提高解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)CMC酶活的能力具有遺傳穩(wěn)定性。

圖4 離子束誘變前后菌落形態(tài)差異

表3 菌株的CMC酶活

3 討論

近年來，通過誘變法提高產(chǎn)纖維素酶菌株產(chǎn)纖維素酶能力的研究取得了較好的進(jìn)展。埃及科學(xué)家El-Ghonemy等［8］采用紫外照射與化學(xué)誘變劑的復(fù)合誘變方法提高了米曲霉NRRL3484產(chǎn)纖維素酶的能力，所得突變株UNAC4K的濾紙酶活是出發(fā)菌的4倍多。Sangwijit等［9］采用低能等離子體誘變解淀粉芽孢桿菌，突變菌株的D/H是出發(fā)菌株的2倍，誘變后菌株比出發(fā)菌株具有更高的產(chǎn)纖維素酶能力。上述研究表明通過誘變提高菌株產(chǎn)纖維素酶的能力是一種有效的誘變方法。低能離子束具有獨特的質(zhì)量沉積效應(yīng)，通過與靶分子或自由基發(fā)生反應(yīng)，參與其分子結(jié)構(gòu)而沉積下來［10］。本研究采用低能N+注入法誘變解淀粉芽孢桿菌S-1，得到比出發(fā)菌株S-1的CMC酶活提高84.40%的突變菌株308，表明N+注入法提高菌株的CMC酶活是一種有效的誘變育種手段，菌種性能的改變可能與N+的質(zhì)量沉積效應(yīng)等有關(guān)。

與傳統(tǒng)的分光光度計測酶活法相比，運用酶標(biāo)儀高通量測CMC酶活法提高了工作效率，克服初篩過程中樣品量大的問題，也使初篩結(jié)果更為直觀。選用CMC酶活作為初篩指標(biāo)可以更直觀的篩選出產(chǎn)酶較高的突變菌株，使整個篩選體系更簡便，篩選數(shù)據(jù)具有更高的說服力。

圖5 突變菌株的遺傳穩(wěn)定性

4 結(jié)論

從含腐敗秸稈的土壤中篩選出產(chǎn)纖維素酶較高的菌株S-1，經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌。并運用低能N+注入突變菌株S-1，低能N+注入前后部分突變菌株菌落形態(tài)變化較大。其中，突變菌株308與出發(fā)菌株S-1相比菌落變小。運用酶標(biāo)儀高通量測酶活法測定突變菌株的CMC酶活作為初篩指標(biāo)，測定5代后突變菌株的CMC酶活作為復(fù)篩指標(biāo)，最終篩選得到突變菌株308，與出發(fā)菌株S-1相比，其CMC酶活增長率達(dá)到了84.40%。表明離子束誘變是一種有效的誘變育種手段。

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