望子龍 羅學(xué)剛 司慧 王焯

（1. 西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，綿陽 621000；2. 西南科技大學(xué)核廢物與環(huán)境安全國防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，綿陽 621000）

鈾（U）礦開發(fā)、提煉及放射性廢棄物處理所造成的污染對(duì)人類生存的安全及整個(gè)生物圈存在嚴(yán)重的威脅。U因其衰變周期長、生物毒性高且難以代謝等特性，若處理不當(dāng)進(jìn)入體內(nèi)，會(huì)引起腎肝的病變，甚至導(dǎo)致死亡［1-2］。因此，治理以U為代表的放射性污染與U礦的開發(fā)及利用具有同等重要的意義。與物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)等傳統(tǒng)修復(fù)方法相比，微生物修復(fù)以其技術(shù)簡(jiǎn)單、費(fèi)用低廉、高效、對(duì)環(huán)境影響小等優(yōu)點(diǎn)引起人們的重視［3-5］。微生物在被污染土壤環(huán)境去毒方面具有獨(dú)特的作用［6］，利用微生物的對(duì)重金屬的吸附及耐受能力，可最大程度壓縮放射性廢棄物體積［7-9］。國內(nèi)外研究中發(fā)現(xiàn)的可富集并耐受U的菌株已有數(shù)十種，如1991年，Lovely等［10］就已發(fā)現(xiàn)異化Fe（III）還原菌G.metallireducens及S. oneidensis可以通過自身還原作用富集U（VI），隨后的研究表明檸檬酸桿菌［11］、酵母菌［12-13］、耐輻射奇球菌［12］、假單胞菌［14］、藻類［15］等都具有富集U（VI）的能力。一般情況下，其對(duì)U的吸附能力為細(xì)菌（400-900 mg/g）＞放線菌（440 mg/g）＞真菌（170-215 mg/g）＞藻類（0-560 mg/g）［2，16-21］。

U污染常伴隨著其他的重金屬污染，這是因?yàn)槎鄶?shù)金屬礦床和非金屬礦床都含有硫化物，并常與重金屬元素共生［22］。U礦中除含有大量U及U的衰變子體如226Ra、Th等帶有放射性核素外還含有很多非放射性的重金屬如銅、鋅、錳（Mn）、鎘、鉛、鉻、鎳及砷（As）等［23-27］。Mn、As作為U的伴生元素，廣泛存在于U污染區(qū)，且鮮有Mn、As在U尾礦區(qū)對(duì)微生物修復(fù)影響的報(bào)道；在國內(nèi)外的研究中，微生物處理放射性核素主要是培養(yǎng)后靜態(tài)吸附研究，對(duì)于培養(yǎng)過程中微生物與放射性核素的相互作用的研究甚少［15］。因此，本實(shí)驗(yàn)嘗試?yán)肬尾礦區(qū)分離的地衣芽孢桿菌在生活狀態(tài)下耐受并富集U、Mn、As，研究其在培養(yǎng)條件下對(duì)U、Mn、As的富集特性，利用紅外光譜（FTIR）探討富集前后菌體的變化。并通過多因素實(shí)驗(yàn)，探究Mn、As對(duì)地衣芽孢桿菌U富集的影響，旨在為U污染區(qū)微生物修復(fù)，超富集植物體減容提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及來源 地衣芽孢桿菌［Bacillus licheniformis BCRC12826（DQ309323）］來源于U尾礦腐爛植物體。由西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院分離鑒定并保存。

1.1.2 試劑 乙酸錳，亞砷酸鈉，乙酸雙氧鈾。U離子（六價(jià)）易與有機(jī)物質(zhì)產(chǎn)生沉淀，導(dǎo)致培養(yǎng)基有效U離子濃度降低，故選取較溶菌肉湯（LB）液體培養(yǎng)基有機(jī)物含量少且成分簡(jiǎn)單清晰的葡萄糖尿素液體培養(yǎng)基［28］。取尿素1 g，葡萄糖50 g，酵母膏0.5 g，硫酸銨1.0 g，磷酸氫二鈉0.5 g，蒸餾水1.5L，121℃滅菌30 min，并將pH調(diào)整至4.5左右。

1.2 方法

1.2.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 配制葡萄糖尿素培養(yǎng)基，調(diào)整pH為4.5。然后分別加入濃度5 000 mg/L的U、Mn、As元素母液，最終配制成U、Mn和As的初始濃度為0 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、75 mg/L和100 mg/L，pH為4.5的澄清培養(yǎng)基。分裝培養(yǎng)基于250 mL錐形瓶中，每濃度設(shè)置5個(gè)平行對(duì)照，并加入吸光度（OD）為1.0的新制地衣芽孢桿菌活化菌液5 mL。置于150 r/min的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)120 h。定時(shí)取樣，并用Thermo Multiskan 酶標(biāo)儀于600 nm處測(cè)量，繪制生長曲線；然后10 000 r/min離心10 min，測(cè)定上清液中U、Mn和As的濃度，并將沉淀烘干，稱量菌體質(zhì)量，計(jì)算微生物對(duì)U、Mn和As的吸附率或吸附量。重金屬吸附率按如下公式計(jì)算［29］：

其中，q為吸附量（mg/g）；Co為U/Mn/As溶液的初始濃度（mg/L）；C為微生物吸附后的平衡濃度（mg/L）；V為溶液體積（L）；M為微生物質(zhì)量（g）。

1.2.2 多因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)采用為二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，設(shè)置U（X1）、Mn（X2）、As（X3）三個(gè)因素，各因素水平值如表1所示。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)方法 根據(jù)表2配制各組重金屬溶液，按表1設(shè)計(jì)的水平向各培養(yǎng)基中加入乙酸雙氧鈾溶液、乙酸錳溶液及亞砷酸鈉溶液，且每瓶均加入OD值為1.0的新制菌懸液5 mL，在30℃，150 r/min搖床中培養(yǎng)72 h。每組取20 mL培養(yǎng)液在10 000 r/min下離心10 min。取上清，過0.45 μm針頭過濾器，測(cè)定剩余U、Mn、As的濃度。

表1 因素水平編碼表

表2 實(shí)驗(yàn)方案及編號(hào)

1.2.4 檢測(cè)方法 本實(shí)驗(yàn)中U元素使用安捷倫7700x電感耦合等離子體串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行測(cè)定［30］，Mn元素使用日立Z-2000原子吸收光譜儀測(cè)定［31］，As元素使用普析PF6非色散原子熒光光度計(jì)測(cè)定［32］。不同元素檢出限如表3所示。

表3 各元素檢出限

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)均采用DPS 7.5軟件進(jìn)行分析，采用Tukey多重比較法。應(yīng)用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)及分析

2.1.1 地衣芽孢桿菌對(duì)U的富集 如圖1所示，地衣芽孢桿菌可在0-100 mg/L的U濃度下可生長，地衣芽孢桿菌在含U培養(yǎng)基中生長的前12 h，不同濃度下的細(xì)菌生長趨勢(shì)與對(duì)照組相當(dāng)，在細(xì)菌生長達(dá)到穩(wěn)定期后，75 mg/L、100 mg/L濃度下表現(xiàn)出對(duì)菌體生長的抑制作用，菌體數(shù)量分別低于對(duì)照組14.58%和31.25%，差異極顯著（P＜0.01）。

圖1 U對(duì)地衣芽孢桿菌生長的影響

由圖2可以看出，鈾酰離子（UO22+）初始濃度與地衣芽孢桿菌對(duì)UO22+的吸附率呈負(fù)相關(guān)，與吸附量呈正相關(guān)。當(dāng)UO22+初始濃度為25 mg/L時(shí)，吸附率到達(dá)87%，吸附量為25.1 mg/g；UO22+初始濃度100 mg/L時(shí)吸附率達(dá)到77.89%，吸附量為243 mg/g。吸附量的大幅上升證明菌體上有大量UO22+的吸附位點(diǎn)，U濃度較低時(shí)菌體對(duì)U的吸附不飽和。吸附率的下降則提示UO22+的升高會(huì)抑制地衣芽孢桿菌的生長，這與圖1相符，同時(shí)，UO22+吸附量的上升使吸附更接近飽和，減弱了菌體對(duì)U的吸附作用。

圖2 地衣芽孢桿菌對(duì)U的吸附率及吸附量

圖3是在0 mg/L和100 mg/L的UO22+條件下培養(yǎng)的地衣芽孢桿菌的紅外譜圖。由圖可知，加入U(xiǎn)的菌體上羥基、羰基特征峰出現(xiàn)偏移，同時(shí)有新的特征峰出現(xiàn)。其中N-H的彎曲振動(dòng)與C-N伸展振動(dòng)的疊加在1 540 cm-1、1 654 cm-1處，此兩峰提示著酰胺鍵的存在；1455 cm-1、1 396 cm-1處吸收峰與C-H（-CH3）的彎曲振動(dòng)有關(guān)，提示含-CH3的物質(zhì)和菌體U的結(jié)合存在聯(lián)系。吸收峰位于1 396 cm-1處與COO-基團(tuán)有關(guān)。1 064 cm-1處為P-O-C以及C-N（胺基）伸縮振動(dòng)的吸收峰，可能是含磷化合物的峰位；菌體積累U后，位于1 232 cm-1處的吸收峰消失，該特征峰可能是P = O和C-S 的伸縮振動(dòng)或C-O與O-H的疊加吸收峰，提示U可能累積也與含磷化合物有關(guān)。在909.56 cm-1處出現(xiàn)的為UO22+的吸收特征峰。

2.1.2 地衣芽孢桿菌對(duì)Mn的富集 如圖4，在不同濃度Mn培養(yǎng)下的地衣芽孢桿菌在前36 h生長狀況相當(dāng)；36 h之后，25-100 mg/L Mn處理的細(xì)菌其數(shù)量均低于對(duì)照組（P＜0.01），表現(xiàn)出Mn對(duì)其生長的脅迫，在120 h時(shí)，25 mg/L組細(xì)菌數(shù)量低于對(duì)照18.18%，差異極顯著；0 mg/L組細(xì)菌數(shù)量低于對(duì)照27.27%，差異極顯著；75 mg/L組菌數(shù)低于對(duì)照25.97%，差異極顯著；100 mg/L組菌數(shù)低于對(duì)照29.87%，差異極顯著。

圖3 在0 mg/L和100 mg/L的UO22+條件下培養(yǎng)的地衣芽孢桿菌紅外譜圖

圖4 Mn對(duì)地衣芽孢桿菌生長的影響及地衣芽孢桿菌對(duì)Mn的吸附率

地衣芽孢桿菌在25 mg/L、50 mg/L、75 mg/L和100 mg/L下吸附率均隨菌體數(shù)量的上升而上升，在菌體數(shù)量穩(wěn)定后逐漸趨于穩(wěn)定，濃度于100 mg/L處理下出現(xiàn)了明顯的脫附現(xiàn)象；地衣芽孢桿菌對(duì)Mn的吸附率隨濃度變化呈遞減趨勢(shì)，在25 mg/L在96 h時(shí)達(dá)到最高為80.44%。

圖5是在0 mg/L和100 mg/L的Mn濃度條件下培養(yǎng)的地衣芽孢桿菌的紅外譜圖?？梢钥吹礁鞣逯底兓淮?，3 303 cm-1、1 654 cm-1處也向低波數(shù)移動(dòng)，提示Mn可能會(huì)與U競(jìng)爭(zhēng)胺基及蛋白質(zhì)的固定位點(diǎn)，同時(shí)，1 064 cm-1處峰值變化不大，即Mn不會(huì)影響U與菌體上的含磷化合物結(jié)合。同時(shí)，2 360 cm-1處的峰消失。

2.1.3 地衣芽孢桿菌對(duì)As的吸附 砷脅迫下地衣芽孢桿菌的生長曲線如圖6所示。前12 h內(nèi)各濃度的As對(duì)細(xì)菌數(shù)量增加的影響均較小，菌體數(shù)量均接近對(duì)照，在12 h之后As脅迫體現(xiàn)較明顯，菌體數(shù)量隨濃度的提高而減少，且As濃度大于50 mg/L對(duì)菌體數(shù)量增加的影響更大。120 h時(shí)50 mg/L組菌體數(shù)相較于對(duì)照減少24.29%，75 mg/L組菌體數(shù)較于對(duì)照減少30.71%，100 mg/L組較對(duì)照減少26.61%，差異均極顯著（P＜0.01）。

地衣芽孢桿菌對(duì)As的吸附率隨濃度變化呈先下降后升高的趨勢(shì)，如圖6所示，25 mg/L處理在108h時(shí)吸附率最高達(dá)到79.44%；在120 h時(shí)，50 mg/L處理為75.31%，75 mg/L處理為76.11%，100 mg/L時(shí)達(dá)到79.73%。

圖5 在0 mg/L和100 mg/L Mn2+條件下培養(yǎng)的地衣芽孢桿菌紅外光譜圖

圖6 As對(duì)地衣芽孢桿菌生長的影響及地衣芽孢桿菌對(duì)As的吸附率

圖7 在0 mg/L和100 mg/LAs條件下培養(yǎng)的地衣芽孢桿菌紅外光譜圖

圖7是在0 mg/L和100 mg/L的As條件下培養(yǎng)地衣芽孢桿菌的紅外譜圖?？芍渥兓饕彩? 303 cm-1、1 604 cm-1處也向低波數(shù)移動(dòng)，以及2 360 cm-1峰的消失，推測(cè)其影響大致與Mn相同。

2.2 多因素實(shí)驗(yàn)及分析

2.2.1 回歸模型的建立 采用DPS軟件中三元二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)方法，得到復(fù)合污染下地衣芽孢桿菌對(duì)U的吸附率與各因子之間的回歸方程為：

α=0.10顯著性檢驗(yàn)，簡(jiǎn)化回歸方程：

結(jié)果表明，對(duì)地衣芽孢桿菌U吸附率有顯著影響的一次項(xiàng)因子是X1（U），有顯著影響的二次項(xiàng)因子是 X3（As）。

2.2.2 偏相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn) 對(duì)地衣芽孢桿菌U吸附率的偏相關(guān)系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果（表4）表明，各因子與地衣芽孢桿菌U吸附率的相關(guān)性表現(xiàn)為：一次項(xiàng)中，X1（U）、X2（Mn）呈現(xiàn)為負(fù)相關(guān)，X3（As）呈現(xiàn)為正相關(guān)；二次項(xiàng)中，X1（U）、X2（Mn）呈現(xiàn)為負(fù)相關(guān)，X3（As）呈現(xiàn)為極顯著負(fù)相關(guān)；交互項(xiàng)中，X1X2（U與Mn）呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，X1X3（U與Mn）、X2X3（Mn與As）呈現(xiàn)為正相關(guān)?？梢奤與Mn濃度對(duì)地衣芽孢桿菌U吸附率呈抑制作用，As濃度呈促進(jìn)作用。

表4 地衣芽孢桿菌U吸附率的偏相關(guān)系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果

2.2.3 單因素效應(yīng)分析 對(duì)原始回歸方程采用“降維法”，得到各因子對(duì)地衣芽孢桿菌U富集的偏回歸方程為：

根據(jù)子方程繪制地衣芽孢桿菌U吸附率隨各因子的變化趨勢(shì)圖。由圖8可知，地衣芽孢桿菌U吸附率與U濃度呈負(fù)相關(guān)，隨U濃度的升高而降低；在Mn濃度低于40 mg/L時(shí)對(duì)U的富集呈促進(jìn)作用，而在Mn濃度大于60 mg/L時(shí)呈現(xiàn)抑制作用，As濃度在60 mg/L以下時(shí)可以促進(jìn)地衣芽孢桿菌對(duì)U的富集，而高于60 mg/L時(shí)則體現(xiàn)出對(duì)U吸附的抑制。

圖8 復(fù)合污染下各因子對(duì)地衣芽孢桿菌U吸附率的影響

3 討論

地衣芽孢桿菌對(duì)U與鎘有著相似的吸附趨勢(shì)，紅外分析顯示，U與菌體的結(jié)合與含磷化合物及蛋白等含羧基甲基等的有機(jī)物有關(guān)，反映出地衣芽孢桿菌對(duì)鈾的吸附主要與細(xì)胞膜及細(xì)胞壁有關(guān)。生物膜外有許多能吸附金屬離子和有機(jī)物的位點(diǎn)，如芳香烴、脂肪族氨基酸形成的蛋白質(zhì)中的疏水區(qū)，與重金屬之間有較高的結(jié)合量和結(jié)合強(qiáng)度［33-34］。同時(shí)，存在于細(xì)胞外的胞外多聚物（EPS），特別是溶解性EPS，對(duì)重金屬的結(jié)合能力更強(qiáng)［35］，這與EPS上的羥基、磷酸基、巰基、酚羥基等官能團(tuán)有關(guān)［36］。有研究表明地衣芽孢桿菌對(duì)Cd2+的富集是通過胞外各功能團(tuán)及表面分泌物實(shí)現(xiàn)的［37］。司慧等［28］認(rèn)為芽孢桿菌對(duì)U的吸附首先發(fā)生于細(xì)胞壁上，而后隨著菌體代謝活動(dòng)等向胞內(nèi)部轉(zhuǎn)移，并在胞內(nèi)積累。

地衣芽孢桿菌對(duì)Mn的吸附趨勢(shì)變化與黃榮［29］的研究相同。Mn、As對(duì)地衣芽孢桿菌富集U的影響可能是多方面的，首先，AsO2-形式存在的As元素不會(huì)競(jìng)爭(zhēng)細(xì)胞表面的負(fù)電性基團(tuán)，胡戀等［38］認(rèn)為陽離子與UO22+競(jìng)爭(zhēng)細(xì)胞表面有限的負(fù)電性基團(tuán)導(dǎo)致菌體對(duì)U的富集量降低，這與多因素實(shí)驗(yàn)中低濃度AsO2-促進(jìn)U的富集，而中等濃度以上的Mn離子抑制U的富集相符。低濃度Mn促進(jìn)U的吸收可能是因?yàn)镸n作為生命所需的微量元素對(duì)細(xì)菌生長影響較小，這與Mn對(duì)地衣芽孢桿菌影響的生長曲線相符。因此在U礦的微生物修復(fù)或微生物減容中應(yīng)考慮聯(lián)合Mn還原菌劑及As富集菌劑［39］共同使用。其次，生長曲線顯示U、Mn、As對(duì)細(xì)菌生長有抑制作用。最后，結(jié)合紅外進(jìn)行分析，在加入U(xiǎn)后，3 303 cm-1、1 064 cm-1等向低波數(shù)偏移，表明菌體對(duì)UO2

2+的吸附位點(diǎn)有胺基及菌體蛋白質(zhì)等位點(diǎn)［40］。1 064 cm-1向低波數(shù)移動(dòng)，且峰值變高，證明U與菌體上磷脂等含磷化合物結(jié)合，并累積起來［38，41-43］。值得注意的是，2 926 cm-1處的 -CH2-峰值變小，而2 360 cm-1的碳碳三鍵或連續(xù)雙鍵處峰明顯升高，可能是U與三鍵或連續(xù)雙鍵化合物結(jié)合，使其含量升高。與此對(duì)應(yīng)的是，Mn與As處理的菌體在2 360 cm-1的峰均消失不見，提示Mn與As使菌體內(nèi)三鍵或連續(xù)雙鍵化合物含量較降低，而此過程可能會(huì)降低菌體對(duì)U的吸附，菌體內(nèi)三鍵或連續(xù)雙鍵化合物結(jié)果與反應(yīng)機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

高于 75 mg/L U、25 mg/L Mn或25 mg/L As對(duì)地衣芽孢桿菌的生長存在著抑制作用；其中U與As對(duì)生長的影響表現(xiàn)在延長了遲滯期，可能是其毒性影響了細(xì)胞代謝；而Mn對(duì)生長的影響體現(xiàn)在對(duì)數(shù)期，可能是影響了菌體的分裂。

地衣芽孢桿菌對(duì)在U、Mn和As有較好的富集作用。單因素時(shí)，最高可以吸附培養(yǎng)基中87%的U、80.44%的Mn，或79.73%的As。

Mn、As均在低濃度時(shí)促進(jìn)地衣芽孢桿菌對(duì)U的吸附，高濃度時(shí)則表現(xiàn)出抑制。Mn濃度低于40mg/L或As濃度低于60 mg/L可以促進(jìn)菌體對(duì)U的吸附；反之當(dāng)Mn或As濃度高于60 mg/L則抑制菌體對(duì)U的吸附。

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