李平 張桂萍 胡建燃

（長治學院 生物科學與技術(shù)系，長治 046011）

連翹［Forsythia suspense（Thunb.）Vahl.］是臨床常用的一味傳統(tǒng)中藥材，屬木犀科植物，主要分布于河北、山西、陜西、山東、安徽西部、河南、湖北以及四川。主要有效成分有連翹酯苷、連翹苷、蘆丁、右旋松脂酚等，現(xiàn)代藥理研究顯示具有抗菌、保肝、保護心臟、提高免疫力、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等作用。山西是我國藥用連翹的主產(chǎn)省份，有研究表明山西所產(chǎn)的連翹在藥理成分及藥效方面具有一定優(yōu)勢。例如，馮帥等［1］發(fā)現(xiàn)山西所產(chǎn)的連翹含有的連翹苷和連翹酯苷A的含量均顯著高于陜西、河南、河北和山東等地所產(chǎn)的連翹；吳婷等［2］的研究表明山西連翹提取物抗甲型流感病毒的效果整體優(yōu)于河南、河北和陜西所產(chǎn)的連翹藥材。Zhang等［3］的研究結(jié)果表明連翹提取物在模式小鼠體內(nèi)能夠發(fā)揮顯著的抗糖尿病和抗高血脂作用；Guo等［4］發(fā)現(xiàn)連翹精油具有顯著的抗細菌作用，Zhang等［5］則發(fā)現(xiàn)連翹提取物對紫色色桿菌和銅綠假單胞菌的細菌群體效應具有強烈的拮抗作用；Zhang等［6］發(fā)現(xiàn)連翹提取物可能通過其抗炎和抗氧化活性拮抗魚藤酮所造成的神經(jīng)毒性，從而在帕金森癥等疾病中發(fā)揮一定的治療作用；Huang等［7］發(fā)現(xiàn)連翹酯苷能夠有效抑制PC12細胞中LPS所誘導的細胞死亡以及ROS的產(chǎn)生，從而發(fā)揮一定的保護功能；Wei等［8］的研究結(jié)果表明連翹苷能夠有效抑制H2O2所造成的細胞氧化應激和凋亡。

本研究以山西省長治市所產(chǎn)的連翹為材料，利用傳統(tǒng)方法提取其總黃酮（Forsythia flavonoids，F(xiàn)F），測定黃酮含量，然后探討其對胃癌細胞MGC80-3增殖的影響，并進一步分析其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 連翹購自山西省長治市昂生大藥房，產(chǎn)地為長治市平順縣；人胃癌細胞MGC80-3購自武漢博士德生物工程有限公司；標準品蘆丁和RPMI-1640培養(yǎng)基購買于北京索來寶生物科技有限公司；胎牛血清購買于杭州四季青生物工程材料有限公司；四氮甲唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、青鏈霉素等購買于北京依托華茂生物科技有限公司；兔抗mTOR抗體、兔抗LC3 II、HPR標記羊抗兔抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；TRIzol試劑購自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備 CO2培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific）； 細 胞 計 數(shù) 儀Cellometer Auto1000（Nexcelom）；倒置顯微鏡CKX41-C31BF（Olympus）；多功能酶標儀SpectraMax M2（Molecular Devices）；蛋白電泳系統(tǒng)（Bio-rad）；高速冷凍離心機（HITACHI）；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）。

1.2 方法

1.2.1 連翹總黃酮的提取及含量測定 參考李富華等［9］報道的方法，進行適當修改，提取連翹總黃酮。具體方法如下：稱取適量的連翹果實，經(jīng)高速勻漿機打碎成粉，精確稱取5 g藥材粉末，按照料液比1∶30加入70%乙醇，利用索氏提取器在80℃下回流提取2 h。收集提取液，將提取液濃縮為膏狀，加50 mL蒸餾水，37℃下充分溶解，置于250 mL分液漏斗，用等體積石油醚萃取3次，棄去石油醚相，合并水相，減壓濃縮為膏狀，在40℃條件下干燥至恒重，即為連翹總黃酮提取物。

參考陶波等［10］報道的方法，進行適當修改，測定連翹總黃酮含量。具體方法如下：精確稱取2.5 mg蘆丁標準品，用10 mL無水甲醇充分溶解，再加入蒸餾水將其體積定容至25 mL，制得標準品溶液。精確吸取蘆丁標準品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置于不同試管中，并用70%乙醇分別定容至10 mL。分別向每根試管中加入5% NaNO2溶液1.0 mL，充分混勻后靜置5 min；分別向每根試管中加入10% Al（NO3）3溶液 1.0 mL，充分混勻后靜置5 min；分別向每根試管中加入4% NaOH溶液 10.0mL和蒸餾水3.0 mL，充分混勻后靜置15 min。以不含蘆丁的溶液為空白，利用分光光度計依次檢測不同濃度標準品OD510值。以O(shè)D510值為縱坐標，蘆丁標準品濃度（mg/mL）為橫坐標，進行線性回歸，獲得回歸方程。利用合適濃度的連翹總黃酮提取物溶液進行上述步驟，計算OD510值，通過回歸方程計算總黃酮含量，黃酮含量為50.7±0.4 mg/g。

1.2.2 MTT實驗 人胃癌細胞MGC80-3采用含10%胎牛血清的RMPI-1640培養(yǎng)基，在5% CO2、37℃的條件下培養(yǎng)，在細胞指數(shù)增長期時，用胰酶-EDTA消化液進行消化。按照1×104細胞/孔的濃度將細胞懸液接種到96孔板中，過夜培養(yǎng)后，加入不同濃度的FF溶液（1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.025、0.0125 mg/mL）處理細胞，并設(shè)置不加藥物的對照組，培養(yǎng)48 h后，向培養(yǎng)液中加入終濃度10% MTT溶液（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，振蕩10 min后，測定OD570值，計算腫瘤細胞抑制率。

1.2.3 平板集落形成實驗 參考戴紅良等［11］報道的方法，進行適當修改，具體步驟如下：按照5×102細胞/孔的濃度將MGC80-3細胞接種至6孔板中，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)過夜；加入不同濃度的FF，繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3 d換液一次，并加入相同濃度的FF，培養(yǎng)14 d后，棄去培養(yǎng)基，無水甲醇固定5 min，用0.2%的結(jié)晶紫甲醇溶液對細胞進行染色，觀察并拍照記錄。

1.2.4 RT-PCR實驗 利用TRIzol試劑并按照其說明書方法提取細胞總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。PCR所用引物如表1所示，擴增條件為：94℃，3 min ；94℃，30 s，60℃，30 s，72℃，20 s，30個循環(huán)；72℃，7 min。PCR產(chǎn)物采用1% 瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄結(jié)果。

表1 相關(guān)引物序列

1.2.5 Western blot實驗 收集指數(shù)期生長的細胞，棄去培養(yǎng)液，加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），于冰上裂解30 min后，在4℃下12 000 r/min離心15 min，收集上清液，并采用Lowry法測定蛋白濃度。經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育過夜、漂洗、二抗常溫孵育1 h、漂洗，然后加入ECL試劑反應，利用Bio-Rad成像系統(tǒng)掃描拍照。

2 結(jié)果

2.1 FF濃度對MGC80-3細胞增殖的影響

通過MTT實驗檢測FF對胃癌細胞MGC80-3增殖的影響。結(jié)果如圖1所示，當FF終濃度為1 mg/mL時，對MGC80-3細胞的抑制率高達86.32%，隨著濃度的降低，抑制率逐漸下降，計算其IC50值為0.297 4 mg/mL，表明FF對胃癌細胞MGC80-3具有明顯的抑制作用，并與藥物劑量呈正相關(guān)關(guān)系。

2.2 長期低濃度FF處理對MGC80-3細胞生長的影響

為進一步探討低濃度的FF對胃癌細胞MGC80-3長期生長的影響，取抑制率不超過10%的FF溶液（終濃度為0.03125 mg/mL，抑制率為7.90%）處理細胞，進行細胞增殖實驗。結(jié)果如圖2所示，從第3天，處理組細胞數(shù)量即明顯少于對照組細胞（P＜0.05），第4天、第5天和第6天，處理組細胞與對照組細胞相比，數(shù)量更少，差異極顯著（P＜0.01）。上述結(jié)果表明，長期低濃度的FF處理細胞仍能抑制其生長。

圖1 FF濃度對MGC80-3細胞的抑制效應

圖2 低濃度的FF對胃癌細胞MGC80-3增殖的影響

2.3 連翹總黃酮提取物對MGC80-3細胞集落形成的影響

平板細胞集落形成實驗結(jié)果如表2所示，終濃度為0.05 mg/mL的FF長期處理MGC80-3細胞，導致其全部死亡，無法形成集落（P＜0.01）。與對照組相比（約453個集落，形成率為90.6%），當FF終濃度為0.025 mg/mL時，大多數(shù)MGC80-3細胞死亡，平板中形成了少量細胞集落（約216個集落，形成率為43.2%），差異極顯著（P＜0.01）；當FF終濃度為0.0125 mg/mL時，所形成的細胞集落未見明顯減少（約445個集落，形成率89.0%）。

2.4 FF對MGC80-3細胞自噬相關(guān)基因表達的影響

2.4.1 半定量PCR檢測相關(guān)基因mRNA表達水平 上述實驗結(jié)果表明FF顯著抑制了MGC80-3細胞的增殖，為進一步探討其潛在分子機制，本研究分析了相關(guān)基因的表達情況。用不同濃度的FF處理細胞后，通過半定量RT-PCR實驗檢測了多個基因的mRNA水平，結(jié)果如圖3-A所示。隨著FF濃度從0.0125 mg/mL提高至0.4 mg/mL，LC3、Bax以及beclin的mRNA水平顯著提高，而mTOR的表達則出現(xiàn)明顯下調(diào)（圖3-B）。由于上述4個基因均為細胞自噬相關(guān)基因，因此以上結(jié)果表明，F(xiàn)F可能促進了MGC80-3細胞的自噬，進而抑制其增殖。

2.4.2 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達 為驗證半定量RT-PCR實驗的結(jié)果，進一步通過Western blot實驗檢測細胞自噬過程關(guān)鍵因子mTOR和LC3 II的表達水平。結(jié)果如圖4-A，B所示，當FF的濃度從0.2mg/mL提高至0.4 mg/mL時，MGC80-3細胞中mTOR蛋白水平顯著降低，而LC3 II的表達明顯增強。該結(jié)果與半定量RT-PCR實驗結(jié)果一致，證實FF的確影響了細胞自噬過程。

表2 細胞集落形成實驗

3 討論

近年來，在腫瘤防治領(lǐng)域，中藥材越來越受到研究者的關(guān)注。有研究表明，白花蛇舌草、半枝蓮、陳皮、黃芩、菟絲子等均具有一定的抗腫瘤作用，而其主要活性成分包括黃酮醇、黃烷酮、異黃酮等天然黃酮類化合物［12］。目前，對于天然黃酮類化合物抑制腫瘤細胞的分子機制集中于影響細胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力及細胞凋亡等方面［13］。黃酮也是連翹的重要成分。目前，國內(nèi)外學者針對連翹黃酮的研究工作，主要集中在提取工藝及體外抗氧活性方面［14-16］，尚未見有文獻報道其具有抗腫瘤作用。本研究以山西長治地區(qū)生長的連翹為材料，利用傳統(tǒng)方法提取其黃酮成分，然后通過細胞水平的MTT實驗證實FF對胃癌細胞MGC80-3增殖和集落形成能力具有顯著的抑制作用。

圖3 半定量PCR檢測相關(guān)基因表達水平

圖4 Western blot實驗檢測相關(guān)蛋白表達水平

細胞自噬（Autophagy）一種廣泛存在于真核細胞中，且在生物進化中高度保守的溶酶體依賴性的降解途徑，通常使細胞適應外周環(huán)境壓力，以避免細胞死亡，所作出的正常生理改變［17］。但是，在某些條件下，細胞自噬過度激活則會引發(fā)II型程序性細胞死亡，即自噬性細胞死亡。細胞內(nèi)自噬平衡的打破與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。自噬過程涉及多個關(guān)鍵因子，如mTOR、Beclin 1、自噬相關(guān)蛋白Atg、Bcl-2、NF-κB等，其中LC3（Atg 8）在自噬過程中轉(zhuǎn)化為LC3 II，其蛋白水平是自噬程度的標志［18］。AMPK/TSC/mTOR 通路的活化及 PI3K/AKT/mTOR 通路的抑制是自噬過程的主要誘因，自噬調(diào)節(jié)的異常在多種癌癥中均有體現(xiàn)［19］。本研究發(fā)現(xiàn)FF提高了胃癌細胞MGC80-3中自噬標志因子LC3 II的蛋白水平，以及相關(guān)蛋白基因Bax和Bcl2的表達；同時，降低了mTOR蛋白水平，進而可能抑制了mTOR相關(guān)信號通路。因此，長治連翹的黃酮成分可能通過誘導細胞自噬過程對胃癌細胞MGC80-3發(fā)揮抑制作用，為連翹在腫瘤預防和治療方面的開發(fā)利用提供理論參考。

4 結(jié)論

連翹黃酮對胃癌細胞MGC80-3增殖具有良好的抑制作用。連翹黃酮能夠顯著抑制mTOR蛋白的表達，同時提高Bax、Beclin 1和LC3Ⅱ的表達水平。

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