鄧加聰，蔣素素，王詩瑤，王志輝 ，張文森，鄭 虹

(1.福建師范大學(xué)福清分校海洋與生化工程學(xué)院，福建福清350300；2.食品軟塑包裝技術(shù)福建省高校工程研究中心，福建福清350300)

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露,與自身分泌物結(jié)合后,經(jīng)充分釀造而成的天然甜物質(zhì)[1]。它是一種高度復(fù)雜的糖類溶液，含有微量元素、氨基酸、蛋白質(zhì)、有機酸、維生素、膠質(zhì)物、蜂花粉和激素等[2]，具有很高的營養(yǎng)價值和保健作用[3]。

百合是一種多年生宿根草本植物，而用百合釀造的酒是一種具有營養(yǎng)、保健、食療等功能的新型飲品[4]，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，百合除含有蛋白質(zhì)、脂肪、還原糖及礦物質(zhì)外，還含有一些特殊的營養(yǎng)成分，如多種生物堿、糖苷、皂苷、酚酸甘油酯及丙酸酯衍生物等多種物質(zhì)[5-6]。這些成分對人體不僅具有較好的滋補功效，而且還具有抗癌、抗疲勞、抗氧化、抗過敏等藥理作用[7-10]。

紅曲的主要活性成分為麥角甾醇、洛伐他汀、豆甾醇和莫納克林[11-12]。這些活性物質(zhì)具有降血糖、降血脂、降血壓等功效，因此在釀酒的過程中添加紅曲,使酒中溶入紅曲所富含的多種活性物質(zhì)，進而使酒有一定的營養(yǎng)和保健功能[13-14]。

蜂蜜酒是稀釋后的蜂蜜經(jīng)酵母菌發(fā)酵后釀制而成。蜂蜜中富含果糖，具有較高的滲透壓，使微生物在此中難以生長繁殖[15-16]。稀釋后的蜂蜜，糖分降低，適合酵母菌生長繁殖和發(fā)酵。目前蜂蜜酒產(chǎn)業(yè)成為地方產(chǎn)業(yè)發(fā)展、農(nóng)民增收的一個特色傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)項目。但就傳統(tǒng)工藝而言，配方因人而異，加工設(shè)備簡陋，家庭作坊式生產(chǎn)繁瑣耗時，導(dǎo)致加工工藝不規(guī)范，工藝參數(shù)模糊。同時蜂蜜酒發(fā)酵過程中由于營養(yǎng)物的限制，存在發(fā)酵速度慢、酒精度低、殘?zhí)橇扛叩葐栴},制約了蜂蜜酒的發(fā)展，為改善這一重大問題，本項目對蜂蜜酒釀造工藝進行研究與改造創(chuàng)新。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

蜂蜜，南平百花酒業(yè)有限公司；紅曲，古田縣力發(fā)曲業(yè)有限責(zé)任公司；百合干，市售；安琪酵母（耐高糖）、安琪酵母（黃酒專用）、生香酵母，安琪酵母股份有限公司；果膠酶（6000 U/mL）、黃酒澄清劑、磷酸二氫鉀、硫酸銨、硫酸銅、次甲基藍、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀、鹽酸、無水葡萄糖、氫氧化鈉、甲基紅等試劑均為分析純，購自國藥集團有限公司。

1.2 主要儀器

酒壇，市售；WYT-4手持式糖量計，泉州中友光學(xué)儀器有限公司；酒精計，上?？茖W(xué)儀器有限公司；PHS-3E酸度計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；FW100高速萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；DK-98-(II)電子調(diào)溫萬能電爐，天津市泰斯特儀器有限公司；DHG-9076A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；SPX-150B-Z生化培養(yǎng)箱，廈門精益興業(yè)科技有限公司；YP402N電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；蒸餾器等玻璃儀器，福州玻璃儀器有限公司。

1.3 百合酶解工藝條件的研究

1.3.1 百合酶解的工藝流程

1.3.2 操作要點

（1）百合干的預(yù)處理：選用無霉變、無蟲蛀的百合干，粉碎機磨成粉末，60目過篩備用。

（2）酶解：取一定量百合干粉，用水溶解（百合干粉∶水=1∶20），用1 mol/L鹽酸將pH值調(diào)至4.5±0.5，加果膠酶，50℃下酶解60 min。

（3）滅酶：將百合酶解漿液在100℃下保溫3～5 min，滅酶活。

1.3.3 酶解工藝優(yōu)化

（1）不同果膠酶添加量對百合酶解效果的影響準確稱取5 g百合粉，加入100 mL的蒸餾水，經(jīng)糊化、冷卻，調(diào)酸至pH4.5±0.5，分別加入果膠酶（酶活活力為60 U/mL）1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL，于50℃下酶解60 min，滅酶后自然冷卻至室溫，用分光光度計測定并計算百合酶解漿液中皂苷的含量。每組試驗做3個平行。

（2）不同溫度對百合酶解效果的影響

準確稱取5 g百合粉，加入100 mL的蒸餾水,經(jīng)糊化、冷卻，調(diào)酸至pH4.5±0.5，加入4 mL果膠酶（酶活活力為60 U/mL），不同溫度（35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃）下酶解60 min，滅酶自然冷卻至室溫待測，測定后計算皂苷含量。每組試驗做3個平行。

（3）不同酶解時間對百合酶解效果的影響

準確稱取5 g百合粉，加入100 mL蒸餾水，經(jīng)糊化、冷卻，調(diào)酸至pH4.5±0.5，添加4 mL果膠酶（酶活活力為60U/mL），45℃下分別以30min、60min、90 min、120 min、150 min、180 min進行酶解，滅酶自然冷卻至室溫待測，測定后計算皂苷含量。每組試驗做3個平行。

（4）3因素3水平試驗優(yōu)化酶解工藝

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用果膠酶的添加量、酶解溫度、酶解時間作為考察因素，選用L9(34)正交表進行試驗分析，測定吸光度后計算皂苷含量。百合酶解的因素和水平表見表1。

表1 百合酶解工藝的因素和水平

1.4 百合蜂蜜酒發(fā)酵工藝條件的研究

1.4.1 百合蜂蜜酒發(fā)酵的工藝流程

1.4.2 操作要點

（1）蜂蜜的稀釋

按蜂蜜∶水=1∶4進行配比，添加20%百合酶解液，調(diào)配成糖度為25～26°Bx百合蜂蜜水溶液。

（2）加熱滅菌

將調(diào)配好的百合蜂蜜水溶液于100℃下保溫30 min，冷卻至室溫。

（3）酵母活化

稱取一定量的安琪酵母接種于質(zhì)量分數(shù)為3%的蜂蜜水，35～37℃活化培養(yǎng)1 h。

（4）菌種擴培

將活化后的酵母菌接種于新鮮的培養(yǎng)基，擴培4.5倍，當發(fā)酵液產(chǎn)生大量氣泡時，擴培結(jié)束。

（5）接種

將擴培液與滅菌后的百合蜂蜜水在酒壇中混勻，并接入適量的紅曲與百合酶解液。

（6）發(fā)酵

24～26℃發(fā)酵培養(yǎng)10～15 d。達到發(fā)酵終點時，75℃下保溫10 min，冷卻至室溫。

（7）壓榨過濾

發(fā)酵液用200目的尼龍絹布壓榨過濾。

（8）澄清、過濾

壓榨后的酒液中加入0.3%的黃酒專用澄清劑，混合均勻后靜置沉淀12 h，上清液經(jīng)硅藻土過濾至清亮透明。

（9）灌裝、殺菌

酒液灌裝封口后，80℃下保溫30 min，殺菌后冷卻至室溫。

1.4.3 釀造工藝優(yōu)化

（1）酵母菌種的選擇對紅曲百合蜂蜜酒品質(zhì)的影響

3種酵母按以下3種不同組合：①生香酵母+安琪酵母（黃酒專用）、②安琪酵母（耐高糖）+生香酵母、③安琪酵母（耐高糖）+安琪酵母（黃酒專用）+生香酵母，接種于百合蜂蜜混合液，加入3%紅曲，30℃發(fā)酵5 d。對發(fā)酵后的產(chǎn)品進行感官評價。

（2）初始糖度對紅曲百合蜂蜜酒品質(zhì)的影響

3種酵母混合，以0.6%接種量接種于不同初始糖度（20 °Bx、22 °Bx、24 °Bx、26 °Bx、28 °Bx、30 °Bx）的百合蜂蜜混合液，添加3%紅曲。對發(fā)酵后的產(chǎn)品進行感官評分。

（3）百合酶解液添加量對紅曲百合蜂蜜酒品質(zhì)的影響

3種酵母混合，以0.6%接種量接種于初始糖度為26°Bx的不同量（10%、15%、20%、25%、30%、35%）的百合蜂蜜混合液，加入3%紅曲。對發(fā)酵后的產(chǎn)品進行感官評分。

（4）酵母接種量對紅曲百合蜂蜜酒品質(zhì)的影響

3種酵母混合，以不同接種量（0.38%、0.41%、0.51%、0.55%、0.66%、0.74%）接種于初始糖度為26°Bx的25%的百合蜂蜜混合液，加入3%紅曲。對發(fā)酵后的產(chǎn)品進行感官評分。

（5）紅曲添加量對紅曲百合蜂蜜酒品質(zhì)的影響

3種酵母混合，以0.66%接種量接種于初始糖度為26°Bx的25%的百合蜂蜜混合液，加入不同量（1%、2%、3%、4%、5%、6%）的紅曲。對發(fā)酵后的產(chǎn)品進行感官評分。

（6）正交試驗優(yōu)化紅曲百合蜂蜜酒釀造工藝

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用蜂蜜水初始糖度、百合酶解液添加量、酵母接種量、紅曲添加量作為考察因素，進行蜂蜜酒釀造的正交實驗設(shè)計。因素和水平見表2。

表2 釀造工藝的因素和水平

1.5 分析方法

1.5.1 溶液中皂苷含量的測定

（1）D101樹脂的預(yù)處理

稱取50 g樹脂浸泡在丙酮中，浸泡24 h，50℃水浴加熱回流18 h，抽濾后丙酮沖洗，再用蒸餾水沖洗，最后與蒸餾水按1∶2混合，備用。

（2）層析柱的制備

采用濕法裝柱（?：1 cm，D：15 cm），樹脂高度為5 cm，之后覆蓋少量脫脂棉，再加入0.2 g中性氧化鋁，最后覆蓋1層脫脂棉并壓緊，備用。

（3）樣品百合總皂苷含量的測定

稱取2 mL百合皂苷提取液于10 mL容量瓶中，溶劑自然揮發(fā)后，用蒸餾水溶解并定容。取5 mL上述溶液，移入備用層析柱（流速控制在0.5 mL/min），用15 mL蒸餾水沖洗，洗去未吸附的雜質(zhì)，再用30 mL 70%乙醇洗脫，收集洗脫液。測定并計算洗脫液中皂苷的含量[6，17]。

（4）標準曲線的制備

稱取干燥后的人參皂苷Re標準品20 mg于5 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容。取5個10 mL具塞試管，分別加入30 μL、60 μL、90 μL、120 μL、150 μL的4 mg/mL人參皂苷Re，自然揮發(fā)除去甲醇，依次加入0.2 mL 5%香草醛冰醋酸溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用）和0.8 mL高氯酸，混勻后，60℃水浴保溫15 min，之后冰水冷卻5 min，以不添加人參皂苷的試劑作為空白參比，552 nm處測定吸光度。以人參皂苷濃度（mg/mL）為橫坐標，以O(shè)D值為縱坐標，繪制標準曲線。標準曲線見圖1，得回歸方程y=0.9749x-0.091，R2=0.9993。

1.5.2 可溶性物的含量測定

圖1 人參皂苷標準曲線

采用手持式折光儀進行測定。

1.5.3 總糖的測定

按GB/T 13662—2008中6.2.2規(guī)定執(zhí)行。

1.5.4 總酸的測定

按GB/T 13662—2008中6.6規(guī)定執(zhí)行。

1.5.5 pH的測定

按GB/T 13662—2008中6.5規(guī)定執(zhí)行。

1.5.6 酒精度的測定

按GB/T 13662—2008中6.4規(guī)定執(zhí)行。

1.6 紅曲百合蜂蜜酒感官評價的方法

根據(jù)紅曲百合蜂蜜酒的色澤、氣味、外觀、口感進行感官評分，樣品隨機提供給10位經(jīng)培訓(xùn)人員品嘗和鑒定，紅曲百合蜂蜜酒的感官評價標準見表3。

2 結(jié)果與分析

2.1 百合酶解工藝的研究

表3 紅曲百合蜂蜜酒的感官評價標準

2.1.1 不同果膠酶的添加量對百合酶解效果的影響（圖2）

圖2 不同果膠酶添加量對百合漿液酶解效果的影響

由圖2可知，隨著果膠酶添加量的增加，糊化后的百合漿液中皂苷的含量也隨之逐漸增加，表明果膠酶對百合漿液的酶解效果逐漸增強；當漿液中果膠酶添加量為240 U/mL時，百合漿液中皂苷的含量達到最高，為0.422 mg/mL，說明此時果膠酶對百合漿液的酶解效果最佳；之后，隨著果膠酶添加量的增加，百合漿液的皂苷含量反而降低，表明果膠酶對百合漿液的酶解效果反而降低。當百合漿液中果膠酶的濃度過高，底物濃度過低，會造成酶的過量，同時添加過量的果膠酶，會產(chǎn)生異味，進而影響百合蜂蜜酒的口感。所以果膠酶的添加量取240 U/mL。

2.1.2 不同酶解溫度對百合漿液酶解效果的影響（圖3）

圖3 不同酶解溫度對百合酶解效果的影響

由圖3可知，當酶解溫度為35～45℃時，隨著酶解溫度的升高，百合漿液與果膠酶充分接觸，百合漿液中皂苷總量逐漸增加，酶解效果逐漸增強；當酶解溫度為45℃時，百合漿液的酶解效果最佳；當酶解溫度超過45℃時，隨著酶解溫度的升高，百合漿液的酶解效果反而下降。所以確定酶解溫度為45℃。

2.1.3 不同酶解時間對百合漿液酶解效果的影響（圖4）

圖4 不同的酶解時間對百合酶解效果的影響

由圖4可知，隨著酶解時間的增加，百合酶解漿液的皂苷含量先增加后緩慢下降。是因為隨著酶解時間的延長，糊化好的百合漿液逐漸被酶解；當酶解時間達到90 min時，百合漿液中的底物酶解完全；之后隨著酶解時間的延長，百合漿液中的酶解效果反而降低。因此確定酶解時間為90 min。

2.1.4 3因素完全試驗優(yōu)化酶解工藝

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選用L9(34)正交表進行正交設(shè)計，結(jié)果見表4、表5。

由表4、表5的實驗數(shù)據(jù)可知，酶解溫度對百合漿液酶解過程的影響最大，其次是果膠酶添加量，而酶解時間的影響最?。患锤饕蛩貙Π俸厦附庑Ч绊懼鞔雾樞驗楣z酶的添加量＞酶解溫度＞酶解時間。同時得到百合漿液酶解的最佳組合為A2B2C2，即果膠酶的添加量為240 U/mL，酶解溫度為45℃，酶解時間為90 min（由于該處理組合不在正交試驗組合中，所以需進行驗證性實驗）。A、B、C 3個因素的F值均大于F0.01，表明3個因素對百合漿液酶解效果的影響均達到極顯著水平。

2.1.5 驗證性實驗

正交試驗結(jié)果的最佳組合A2B2C2和正交試驗結(jié)果表中的皂苷總量最高的試驗組合A2B1C2，分別做3組平行試驗，測定皂苷含量，以百合酶解漿液的皂苷總量為指標，取平均值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，組合A2B2C2和組合A2B1C2的百合酶解漿液的皂苷含量分別為1.674 mg/mL和1.645 mg/mL，試驗組合為A2B2C2的百合酶解漿液的皂苷總量較高，而且從經(jīng)濟效益方面考慮，此試驗組合的可行性較好。因此,百合酶解的最佳試驗組合為A2B2C2，即果膠酶的添加量240 U/mL、酶解溫度為45℃、酶解時間90 min。

表4 酶解工藝正交試驗的直觀分析表

表5 百合酶解工藝正交試驗方差分析表

表6 不同酵母菌種對紅曲百合蜂蜜酒品質(zhì)的影響

2.2 紅曲百合蜂蜜酒釀造工藝的優(yōu)化

2.2.1 酵母菌種對紅曲百合蜂蜜酒品質(zhì)的影響

3種酵母的不同組合對紅曲百合蜂蜜酒的影響結(jié)果見表6。

由表6可知，在3個菌種混合發(fā)酵條件下，酒的口味舒適、香氣協(xié)調(diào)，在同水平試驗中為最佳，因此較優(yōu)的發(fā)酵菌種為3個菌種混合。

2.2.2 初始糖度對紅曲百合蜂蜜酒品質(zhì)的影響

在3%紅曲添加量，3個菌種混合條件下，采用不同百合蜂蜜混合液初始糖度進行發(fā)酵，對發(fā)酵后的產(chǎn)品進行感官評分，結(jié)果見表7。

由表7可知，隨著起始糖度的加大，殘?zhí)窃龆?，得到的蜂蜜酒酒精度增高，初始糖度太高抑制酵母的生長代謝，并且殘?zhí)潜容^高，酒體渾濁。綜上分析結(jié)果，確定最佳蜂蜜水起始糖度為26°Bx。

2.2.3 百合酶解液添加量對紅曲百合蜂蜜酒品質(zhì)的影響

以蜂蜜水起始糖度為26°Bx、3%紅曲添加量、混合酵母菌接種量0.8%，采用不同百合酶解液添加量進行發(fā)酵，對發(fā)酵后的產(chǎn)品進行感官評分，結(jié)果見表8。

表7 初始糖濃度對百合蜂蜜酒的品質(zhì)影響

表8 不同百合酶解液添加量對百合蜂蜜酒品質(zhì)的影響

由表8可知，隨著百合酶解液添加量的增大，殘?zhí)菧p少，得到的蜂蜜酒酒精度增高。采用25%～35%百合酶解液添加量時，雖然酒精度較高，殘?zhí)菂s較低，酒體感官品質(zhì)下降。綜上分析，確定發(fā)酵的最佳百合酶解液添加量為25%。

2.2.4 酵母接種量對紅曲百合蜂蜜酒品質(zhì)的影響

以蜂蜜水起始糖度為26°Bx、3%紅曲添加量、百合酶解液添加量為25%，使用不同的酵母接種量對蜂蜜百合酶解液進行發(fā)酵，對產(chǎn)品進行感官評分，結(jié)果見表9。

表9 不同酵母接種量對百合蜂蜜酒品質(zhì)的影響

由表9可知，隨著酵母接種量的增大，殘?zhí)菧p少，得到的蜂蜜酒酒精度增高。采用0.74%接種量時，雖然酒精度較高，殘?zhí)且草^低，但其酒體感官品質(zhì)下降。綜合以上分析結(jié)果，確定發(fā)酵的酵母最佳接種量為0.66%。

2.2.5 紅曲添加量對紅曲百合蜂蜜酒品質(zhì)的影響

以蜂蜜水起始糖度為26°Bx、酵母接種量為0.66%、百合酶解液添加量為25%，采用不同的紅曲添加量，對產(chǎn)品進行感官評分，結(jié)果見表10。

表10 不同紅曲添加量對百合蜂蜜酒品質(zhì)的影響

由表10可知，隨著紅曲添加量的加大，發(fā)酵速度過快，大于糖化速度，酒精度增高，但殘?zhí)窃龃?。紅曲添加量比較大，會抑制酵母菌的生長代謝，并且糖度較高，酒體偏渾濁。綜上分析，確定最佳紅曲添加量為4%。

2.2.6 正交試驗優(yōu)化紅曲百合蜂蜜酒釀造工藝

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，以蜂蜜水初始糖度、百合酶解液添加量、酵母接種量、紅曲添加量作為考察因素，對紅曲百合蜂蜜酒的釀造工藝進行優(yōu)化實驗。結(jié)果及分析見表11、表12。

由表11、表12可看出，通過正交分析，影響產(chǎn)品感官品質(zhì)的各因素的主次順序為C＞B＞A＞D，即酵母接種量＞百合酶解液添加量＞蜂蜜水初始糖度＞紅曲添加量；同時得到較佳的釀造工藝組合為A3B3C3D2，即蜂蜜水初始糖度（A）為26 °Bx，蜂蜜百合酶解液添加量（B）為25%，酵母接種量（C）為0.66%，紅曲添加量（D）為4%；置信度為95%，4個因素對感官評價的影響均達到極顯著效果。

采用正交試驗結(jié)果的最佳組合A3B3C3D2和正交試驗結(jié)果表中的評分最高的試驗組合A3B1C3D2進行驗證實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，組合A3B3C3D2和組合A3B1C3D2的感官評分分別為89分和 87分，且A3B3C3D2酒體豐滿、清亮透明、光澤度好，口感醇厚細膩，各結(jié)果均表明組合A3B3C3D2的效果更佳。

最后以3 L投料按照組合A3B3C3D2進行3個批次的驗證試驗，對產(chǎn)品的酒精度、糖含量及最終pH值進行檢測，并與標準產(chǎn)品要求進行比較。結(jié)果見表13。

表11 釀造工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果分析表

表12 釀造工藝對感官評價影響的方差分析表

表13 驗證試驗結(jié)果測定

表13結(jié)果表明，3批次的產(chǎn)品各項指標均符合要求。所以最終確定最佳工藝為A3B3C3D2即蜂蜜水初始糖度（A）為26°Bx，蜂蜜百合酶解液添加量（B）為25%，酵母接種量（C）為0.66%，紅曲添加量(D)為4%。

3 結(jié)論

3.1 百合酶解正交試驗結(jié)果表明，最優(yōu)酶解工藝條件組合為A2B2C2，即果膠酶的添加量240 U/mL、酶解溫度為45℃、酶解時間90 min。

3.2 通過正交試驗確定紅曲百合蜂蜜酒的最優(yōu)釀造工藝條件為：A3B3C3D2，即蜂蜜水初始糖度（A）為26°Bx，蜂蜜百合酶解液添加量（B）為25%，酵母接種量（C）為0.66%，紅曲添加量（D）為4%，在此條件下，生產(chǎn)的紅曲百合蜂蜜酒酒體豐滿、清亮透明、光澤度好，口感醇厚細膩，感官評分為89分。

3.3 對最佳釀造工藝組合進行驗證實驗，表明該工藝合理可行。所得的產(chǎn)品純正柔和，各理化指標：酒精度為13.0%vol、糖度為12.0 g/L、pH3.2，均符合發(fā)酵飲料的標準，適合于批量化生產(chǎn)。結(jié)合當前的農(nóng)業(yè)現(xiàn)狀，紅曲百合蜂蜜酒具有廣闊的應(yīng)用前景。

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