張 倩 ，安明哲 ，謝正敏 ，魏金萍 ，葉華夏 ，黃 劍

(1.五糧液股份有限公司，四川宜賓644000；2.中國輕工業(yè)濃香型白酒固態(tài)發(fā)酵重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓644000)

白酒在我國擁有相當(dāng)悠久的歷史，與我國文化早已密不可分，而濃香型白酒更是在白酒中占據(jù)著非常重要的地位。白酒中98%以上的成分為水和乙醇，而剩下的不到2%的微量成分決定著白酒的風(fēng)味和品質(zhì)。這些微量成分統(tǒng)稱為風(fēng)味物質(zhì)，主要包括酯類、多元醇、高級醇、醛類、有機(jī)酸及其他芳香族化合物和雜環(huán)類化合物等。研究者們通過GC-O/MS、GC-MS、GC-FPD、HPLC、GC×GCTOFMS、GC-FID、GC等[1-12]多種方法對白酒風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了深入研究，成功分離并定性了多種風(fēng)味成分，建立了白酒特征圖譜，但這些方法只能判別風(fēng)味成分的多少及有無，卻不能鑒定這種風(fēng)味成分與白酒主體是否同源、是否有外源添加。隨著檢測技術(shù)的高速發(fā)展，濃香型白酒中的風(fēng)味物質(zhì)將會被逐一揭秘，這為濃香型白酒風(fēng)味物質(zhì)的非法添加提供了技術(shù)基礎(chǔ)[12]，故急需找到一種可以辨別濃香型白酒是否添加了外源風(fēng)味物質(zhì)的方法來填補(bǔ)這一技術(shù)空缺。

國際上，穩(wěn)定同位素技術(shù)由于揭示了產(chǎn)品特征化合物原子水平的信息，而該信息與原料、工藝息息相關(guān)，因此被廣泛應(yīng)用于蜂蜜、食用油、葡萄酒、果汁飲料等食品的鑒別[13-19]；國內(nèi)，鐘其頂?shù)萚20-23]建立了白酒中乙醛、正丁醇、異戊醇、乳酸乙酯和乙醇δ13C的檢測方法，為鑒別固態(tài)法白酒中是否有外源添加提供了技術(shù)支持，但其并不適用于濃香型白酒風(fēng)味物質(zhì)δ13C的檢測。本試驗(yàn)在研究的過程中，借鑒前人的檢測經(jīng)驗(yàn)，建立了濃香型白酒中幾種重要風(fēng)味物質(zhì)（異戊醇、己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸和己酸）δ13C的檢測方法，為濃香型白酒中是否添加外源風(fēng)味物質(zhì)的鑒別技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：市售品牌濃香型白酒（52%vol）。

試劑及耗材：丙酮、己酸乙酯、異戊醇、乳酸乙酯、乙酸、己酸，均為從市場上購買的HPLC級試劑；除丙酮外，其余試劑皆用EA-IRMS（參考物質(zhì)為IAEA-CH-6和IAEA-CH-3）標(biāo)定δ13C值；氦氣（純度≥99.999%）。

儀器設(shè)備：AI 1310自動進(jìn)樣器，Trace GC Ultra氣相色譜儀，GC Isolink燃燒轉(zhuǎn)化裝置，Delta V Advantage穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀，均為Thermo Fisher公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 前處理

樣品：將白酒試樣用丙酮試劑稀釋5倍后，搖勻，移入進(jìn)樣瓶，待測。

標(biāo)樣：按照濃香型白酒中各風(fēng)味物質(zhì)的比例將已標(biāo)定δ13C值的6.0 μL異戊醇、15.0 μL己酸乙酯、6.5 μL乳酸乙酯、12.5 μL乙酸、15.0 μL己酸加入到5 mL丙酮中，搖勻，再取100 μL混合溶液到裝有1400 μL丙酮的進(jìn)樣瓶中，搖勻，待用。

1.2.2 GC條件

TR-WAXMS毛細(xì)管柱（60m×0.25mm×0.25μm）；載氣為高純氦氣，恒流模式，流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣體積為0.7～1 μL，進(jìn)樣口溫度為250℃；升溫程序?yàn)椋浩鹗紲囟?5℃，保持5 min，以4℃/min升溫至80℃后保持4 min，再以6℃/min升溫至220℃并保持4 min。

1.2.3 數(shù)據(jù)表示

在自然界中，13C/12C變化微小，難以測得其真實(shí)值，故采用相對測量法表示樣品中13C/12C，結(jié)果以δ（千分差‰）表示：

δ13C=（R樣品/RV-PDB-1）× 1000

式中：R樣品——樣品中13C/12C比值；

RV-PDB——國際基準(zhǔn)物質(zhì)V-PDB的13C/12C比值，13C/12C=（11237.2± 90）× 10-6，本文中所有數(shù)據(jù)均基于V-PDB標(biāo)準(zhǔn)計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法表現(xiàn)

根據(jù)1.2.1設(shè)定的方法，處理濃香型白酒樣品后，其風(fēng)味物質(zhì)離子流圖見圖1。由圖1可知，濃香型白酒樣品中異戊醇、己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸、己酸的離子峰強(qiáng)度均處于穩(wěn)定同位素質(zhì)譜1～10 V線性測定范圍內(nèi)，并具有非常好的分離度，說明此方法適合于濃香型白酒風(fēng)味物質(zhì)δ13C的檢測。

圖1 濃香型白酒風(fēng)味物質(zhì)GC-IRMS圖譜

2.2 方法重復(fù)性

按照1.2中設(shè)定的方法，標(biāo)樣和濃香型白酒樣品經(jīng)相應(yīng)前處理后，用GC-IRMS連續(xù)6次測定市場上3種品牌濃香型酒樣中異戊醇、己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸、己酸的δ13C值，并用標(biāo)樣標(biāo)定濃香型酒樣，結(jié)果見表1。

表1 多次測定濃香型酒樣中風(fēng)味物質(zhì)的δ13C值 （‰）

表2 不同比例外源添加后濃香型白酒1風(fēng)味物質(zhì)δ13C值 (‰)

由表1可知，品牌不同、原料不同可導(dǎo)致3種濃香型白酒擁有不同風(fēng)味物質(zhì)δ13C值；用GC-IRMS測定濃香型酒樣中異戊醇、己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸、己酸的δ13C值時，標(biāo)準(zhǔn)偏差STD均小于國際穩(wěn)定同位素精度測試允許值0.2‰，說明用GC-IRMS測定濃香型白酒風(fēng)味物質(zhì)δ13C的重復(fù)性良好，儀器穩(wěn)定性高。

2.3 方法再現(xiàn)性

在不同的時間，按照1.2.1的方法處理同一濃香型酒樣后，以1.2的方法測定該酒樣中異戊醇、己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸、己酸的δ13C值，并用標(biāo)樣標(biāo)定，結(jié)果見圖2。

圖2 不同時間測定同一濃香型白酒的風(fēng)味物質(zhì)δ13C值

在5 d時間內(nèi)分5次，每次平行測定2次同一濃香型白酒（52%vol）的風(fēng)味物質(zhì)δ13C值，發(fā)現(xiàn)異戊醇δ13C值穩(wěn)定在-28.8‰～-28.5‰范圍內(nèi)、己酸乙酯δ13C值穩(wěn)定在-24.5‰～-24.2‰范圍內(nèi)、乳酸乙酯δ13C值穩(wěn)定在-16.6‰～-16.3‰范圍內(nèi)、乙酸δ13C值穩(wěn)定在-25.0‰～-24.6‰范圍內(nèi)、己酸δ13C值穩(wěn)定在-26.7‰～-26.2‰范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于國際穩(wěn)定同位素精度測試允許值0.2‰，說明用此方法測定濃香型白酒風(fēng)味物質(zhì)δ13C的再現(xiàn)性良好。

2.4 添加外源風(fēng)味物質(zhì)對濃香型白酒風(fēng)味物質(zhì)δ13C值的影響

測得本研究所用濃香型白酒樣1中異戊醇、己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸、己酸的摩爾含量后，分別向其中添加不同摩爾比例的外源風(fēng)味物質(zhì)，獲得不同風(fēng)味物質(zhì)添加量的濃香型白酒1樣品，測定其風(fēng)味物質(zhì)δ13C值，結(jié)果列于表2。

從表2可以看出，外源添加物質(zhì)δ13C與濃香型酒樣1中相應(yīng)風(fēng)味物質(zhì)δ13C的絕對差值無論大還是小，只要添加一定量的外源物質(zhì)，就可能使?jié)庀阈途茦?相應(yīng)風(fēng)味物質(zhì)δ13C偏離穩(wěn)定范圍，說明本文測定方法有望為鑒別濃香型白酒是否外源添加風(fēng)味物質(zhì)提供技術(shù)支持。

3 結(jié)論

建立了濃香型白酒中幾種重要風(fēng)味物質(zhì)（異戊醇、己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸、己酸）δ13C值的GCIRMS測定方法，該方法結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定性好、風(fēng)味物質(zhì)分離度佳、重復(fù)測定標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于國際穩(wěn)定同位素精度測試允許值0.2‰，完全滿足測定需求；通過添加外源風(fēng)味物質(zhì)模擬實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了本試驗(yàn)測定方法有望為濃香型白酒是否外源添加風(fēng)味物質(zhì)的鑒別工作提供技術(shù)支持，但由于本試驗(yàn)是基于特定樣品范圍內(nèi)（市售某些品牌52%vol濃香型白酒）的探討性研究，對于其他品牌、其他濃度白酒的驗(yàn)證仍需開展進(jìn)一步的工作。

[1] 范海燕,范文來,徐巖.應(yīng)用GC-O和GC-MS研究豉香型白酒揮發(fā)性香氣成分[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2015,41(4)：147-152.

[2]FAN W L,QIAN M C.Identification of aroma compounds in Chinese“Yanghe Daqu”liquor by normal phase chromatography fractionation followed by gas chromatography/olfactometry[J].Flavour and fragrance journal,2006,21(2)：333-342.

[3]FAN W L,SHEN H Y,XU Y.Quantification of volatile compounds in Chinese soy sauce aroma type liquor by stir bar sorptive extraction and gas chromatography-mass spectrometry[J].Journal of the science of food and agriculture,2011,91(7)：1187-1198.

[4]胡國棟.氣相色譜法在白酒分析中的應(yīng)用現(xiàn)狀與回顧[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2003,29(10)：65-69.

[5]尋思穎,董睿,彭黔榮,等.高效液相色譜法測定醬香型白酒中揮發(fā)性酚類物質(zhì)[J].食品科學(xué),2012,33(24)：239-243.

[6]徐占成,陳勇,王雙.利用全二維氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)和吸附攪拌萃取技術(shù)對中國名酒劍南春酒體風(fēng)味質(zhì)量特色的研究[J].釀酒,2012,39(5)：6-8.

[7]周慶伍,徐祥浩,湯有宏,等.基于全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜分析技術(shù)同時測定白酒中10種吡嗪類物質(zhì)[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2015(26)：354-355.

[8] 向雙全,張志剛.GC-FID快速分析濃香型白酒中的主要成分[J].釀酒科技,2012(3)：92-93.

[9]季克良,郭坤亮,朱書奎,等.全二維氣相色譜/飛行時間質(zhì)譜用于白酒微量成分的分析[J].釀酒科技,2007(3)：100-102.

[10]FAN W L,QIAN M C.Characterization of aroma compounds of Chinese“Wuliangye”and“Jiannanchun”liquors by aroma extract dilution analysis[J].Journal of agricultural and food chemistry,2006,54(7)：2695-2704.

[11]練順才,蘭世蓉,劉英.大曲濃香的老窖酒香氣成分初探[J].釀酒科技,1995(2)：62-63.

[12]張琦,徐勇,沈才洪,等.濃香型白酒揮發(fā)性風(fēng)味成分分析研究進(jìn)展[J].釀酒科技,2017(12)：98-104.

[13]KELLY S D,RHODES C.Emerging techniques in vegetable oil analysis using stable isotope ratio mass spectrometry[J].Grasas y aceites,2002,53(1)：34-44.

[14]CAMIN F,PAVONE A,BONTEMPO L,et al.The use of IRMS,1H NMR and chemical analysis to characterise Italian and imported Tunisian olive oils[J].Food chemistry,2016,196：98-105.

[15]TANJA P,NIVES O,DORIS P,et al.Fatty acid composition and δ13C isotopic ratio characterisation of pumpkin seed oil[J].Journal of food composition and analysis,2016,53：85-90.

[16]CROFT L R.Stable isotope mass spectrometry in honey analysis[J].trends in analytical chemistry,1987,6(8)：206-209.

[17]MARIJAN N,DORIS P,NIVES O.Discrimination between Slovenian cow,goat and sheep milk and cheese according to geographical origin using a combination of elemental content and stable isotope data[J].Journal of food composition and analysis,2016,52：16-23.

[18]KARMEN B B,KLEMEN E,DARJA M,et al.Isotopic and elemental characterisation of Slovenian apple juice according to geographical origin:preliminary results[J].Food chemistry,2016,203：86-94.

[19]CAMIN F,DORDEVIC N,WEHRENS R,et al.Climatic and geographical dependence of the H,C and O stable isotope ratios of Italian wine[J].Analytica chimica acta,2015,853：384-390.

[20]鐘其頂,王道兵,熊正河.固態(tài)法白酒與固液法白酒的同位素鑒別技術(shù)[J].質(zhì)譜學(xué)報,2014,35(1)：66-71.

[21]王道兵,鐘其頂,李國輝,等.發(fā)酵乙醇中13C/12C分布的影響因素研究[J].釀酒科技,2014(11)：6-9.

[22]鐘其頂,熊正河,王道兵.一種鑒別固態(tài)法白酒真?zhèn)蔚姆椒ǎ篊N102384947A[P].2012-03-21.

[23]陳文斌,鐘其頂,王道兵,等.氣相色譜-同位素質(zhì)譜（GC-C-IRMS）測定飲料酒中乙醇13C/12C比值方法研究[J].釀酒科技,2013(5)：143-146.