周鑫達(dá) 畢曉麗 張書芬

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）是發(fā)酵型食物天然產(chǎn)生的污染物，在發(fā)酵食物中廣泛存在，被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)評定為2A類對人體可能致癌的物質(zhì)。發(fā)酵乳是人日常生活中常見的食品，發(fā)酵乳中的EC含量雖然不高，但仍存在一定的風(fēng)險?，F(xiàn)行的國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.223- 2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基甲酸乙酯的測定》和中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 0285-2012《出口酒中氨基甲酸乙酯殘留量檢測方法 氣相色譜-質(zhì)譜法》主要是針對酒類產(chǎn)品和醬油中EC的檢測，還無適用于發(fā)酵乳的標(biāo)準(zhǔn)，因此有必要建立對其中的EC含量進(jìn)行監(jiān)測的方法。本研究采用基質(zhì)分散固相萃?。∕SPD）結(jié)合氣相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜 （GC- MS/MS）檢測發(fā)酵乳中的氨基甲酸乙酯，具有快速、準(zhǔn)確、高效，可滿足日常檢測的需求。

設(shè)備與材料

儀器設(shè)備。Thermo TSQ 8000 Evo/1310型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，梅特勒-托利多儀PL602E/02型電子天平，SRATORIUS CP225D型分析天平，湘儀TGL- 20M高速冷凍離心機(jī)，IKA VORTEX GENIUS 3渦旋混合儀，MILLI- Q超純水機(jī)，Biotage TurboVap LV型氮吹儀，梅特勒-托利多儀Five Easy Plus 28型pH計(jì)。

主要試劑。氨基甲酸乙酯（EC）標(biāo)準(zhǔn)品：Dr. Ehernstorfer，純度98.5%；氨基甲酸乙酯- D5（EC- D5）標(biāo)準(zhǔn)品：Dr.Ehernstorfer，純度99.6%。乙酸乙酯（色譜純），乙腈（色譜純），鹽酸（優(yōu)級純），氯化鈉（分析純），超純水，N-丙基乙二胺（PSA）。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制：分別稱取折算純度后的氨基甲酸乙酯和氨基甲酸乙酯- D5標(biāo)準(zhǔn)品10mg（精確到0.01mg）至10mL容量瓶中，乙腈溶解，定容，配置成1000mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于- 18℃下避光保存。

標(biāo)準(zhǔn)使用液的配制：移取100μL氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)儲備液，乙腈稀釋至10mL，配制成10mg/L的標(biāo)準(zhǔn)使用液。移取10μL氨基甲酸乙酯- D5標(biāo)準(zhǔn)儲備液，乙腈稀釋至10mL，配制成1mg/L的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線用乙酸乙酯：乙腈（V：V=1：3）配制，氨基甲酸乙酯的質(zhì)量濃度為：10，20，50， 100，200，500μg/L，內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為50μg/ L。

實(shí)驗(yàn)方法

樣品處理。移取約樣品5g，加入100ng氨基甲酸乙酯- D5內(nèi)標(biāo)，渦旋混勻，用3mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH值為4.50±0.1左右，8000r/min，4℃冷凍離心5min，移取上清液于50mL離心管中。沉淀再次用5mL水振搖提取，離心后合并上清液，備用。

凈化。備用液離心管中加入2g氯化鈉、5mL乙酸乙酯，渦旋震蕩5min，移取有機(jī)相層于10mL氮吹定量管中；水相再次用5mL乙酸乙酯提取，合并有機(jī)相。室溫下氮吹至約0.5mL（不可吹干），用乙腈定容至2mL，加入200mg PSA，渦旋混勻，沉淀后取上清液過有機(jī)膜供儀器分析。

儀器條件。T h e rm o T S Q 8 1 0 0 E vo/1310三重四級桿氣質(zhì)聯(lián)用儀，進(jìn)樣口溫度230℃，不分流進(jìn)樣；色譜柱：TGWAXMS（30m×0.25mm×0.25μm），初始溫度50℃，保持1min，再以8℃/min升溫至180℃，保持0min，最后以30℃/min升溫至240℃，保持5min；進(jìn)樣量2μL；高純氦氣（He）為載氣，流速1.0mL/min，傳輸線溫度250℃ ，離子源溫度280℃ ，四級桿I溫度150℃，四級桿II溫度150℃；猝滅氣（He）流速2.25mL/min，碰撞氣（N2）流速1.5mL/min。電離方式：EI源，電離能量70eV，監(jiān)測離子對m/z 62/44（16eV） 、m/z 62/45（20eV），m/ z 64/44（18eV） 、m/z 64/46（18eV）；溶劑延遲8min。

定性定量方法。定性方法：以m/z 62為EC母離子經(jīng)裂解后得到的碎片離子m/z 44、m/ z 45，豐度比為100：49為參照，樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間一致，且碎片離子豐度比與標(biāo)準(zhǔn)品符合（允許±20%偏差），可確證為目標(biāo)分析物。以m/z 64為EC- D5母離子經(jīng)裂解后得到的碎片離子m/z 44、m/z 46，豐度比為100：67為參照，樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間一致，且碎片離子豐度比與標(biāo)準(zhǔn)品符合（允許±20%偏差），可確證為內(nèi)標(biāo)物。

定量方法：以m/z 62/44；m/z 64/44為定量離子對，內(nèi)標(biāo)法定量測定，縱坐標(biāo)為豐度值比值，橫坐標(biāo)為系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

結(jié)果與分析

前處理?xiàng)l件選擇。發(fā)酵乳中蛋白質(zhì)、脂肪、糖類等含量較高，基質(zhì)復(fù)雜、干擾較多，要測定其中的氨基甲酸乙酯需要先對樣品進(jìn)行凈化處理，多數(shù)文獻(xiàn)采用直接提取法和SPE固相萃取法前處理，本實(shí)驗(yàn)采用等電點(diǎn)沉淀-基質(zhì)固相分散萃取法前處理。比較這三種方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)直接提取法雜質(zhì)干擾較嚴(yán)重回收率較低，SPE固相萃取法與等電點(diǎn)沉淀-基質(zhì)固相分散萃取法均能達(dá)到較好的凈化效果，但回收率不高，所以考慮加入同位素內(nèi)標(biāo)以提高回收率及穩(wěn)定性。其次SPE固相萃取法需要使用的有機(jī)試劑量大，固相萃取柱成本較高，操作步驟多，檢測效率低。而等電點(diǎn)沉淀-基質(zhì)固相分散萃取-內(nèi)標(biāo)法消耗試劑量小，成本低，檢測效率高，所以選用等電點(diǎn)沉淀-基質(zhì)固相分散萃取-內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行樣品前處理實(shí)驗(yàn)。

質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線。運(yùn)用AUTOSRM優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)，得到EC的特征母離子有m/z 44、62、74，EC- D5的特征母離子有m/z 44、64、74。選擇豐度最大的m/z 62作為EC的母離子，m/z 64作為EC- D5的母離子，進(jìn)行裂解能量優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖1所示。

從圖1中可以看出，m/z 62離子在裂解能量為16eV的時候，能夠得到豐度最大的子離子m/z 44，豐度比100：49。m/z 64離子在裂解能量為18eV的時候，能夠得到豐度最大的子離子m/z 44，豐度比100：67，結(jié)果見圖2。

所以選用m/z 62/44（16e V ） 、m/ z 62/45（20eV）和m/z 64/44（18eV） 、m/z 64/46（18eV）進(jìn)行SRM監(jiān)測掃描，SRM色譜圖結(jié)果見圖3。

在上述優(yōu)化條件下，將系列標(biāo)準(zhǔn)溶液依次進(jìn)樣，內(nèi)標(biāo)法建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，結(jié)果見圖4。由圖4可知，EC在10～500μg/L的范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.02235x+0.0646，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998。

檢出限與回收率。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線方程回歸系數(shù)R2=0.9998。根據(jù)檢出限定義單位時間內(nèi)進(jìn)入檢測器的組分所產(chǎn)生的信號等于3倍基線噪聲時的量。

稱取六份發(fā)酵乳樣品各5.0g，加標(biāo)20μg/ kg，按照實(shí)驗(yàn)方法處理，上機(jī)分析。計(jì)算得到檢出限濃度為1.25μg/L，折算為質(zhì)量濃度為0.5μg/kg，數(shù)據(jù)結(jié)果見表1。

當(dāng)加標(biāo)量為20μg /kg時，回收率在93.6% ～104.5%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=4.1% ，具體數(shù)據(jù)見表2。

通過前處理?xiàng)l件篩選，采用等電點(diǎn)沉淀-基質(zhì)固相分散萃取-內(nèi)標(biāo)法提取凈化，氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC- MS/MS）法測定發(fā)酵乳中的氨基甲酸乙酯含量的方法。相比其他方法該方法處理簡單，有效較少雜質(zhì)干擾，試劑用量少，回收率穩(wěn)定。該方法的線性方程回歸系數(shù)R2=0.9998，方法檢出限0.5μg/kg，當(dāng)加標(biāo)量為20μg/kg時，回收率在93.6%～104.5%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD =4.1%， 能滿足發(fā)酵乳中氨基甲酸乙酯檢測的需求。