杜志國,張廷榮,宋俊霖,黃 凱,王 森,張麗萍,溫奇鳳,項露娟,郭 穎,尹燕博

(1.青島農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,山東 青島 266109;2.青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院,山東 青島 266109;3.青島農(nóng)業(yè)大學中心實驗室,山東 青島 266200;4.青島博隆實驗動物有限公司,山東 青島 266200;5.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院輸血科 ,遼寧 沈陽 110000)

比格犬被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學、生物學、病理學、腫瘤學、免疫學、藥理學、生物化學等生命科學領(lǐng)域[1]。目前實驗動物研究人員已對比格犬的能量、蛋白需求[2-3],主要器官系數(shù)[4],心電圖[5-6]等基礎(chǔ)數(shù)據(jù)做了詳細測定,但對比格犬紅細胞壓積、脆性的報道較少。隋麗華、王冬平等對8月齡以下的比格犬的紅細胞壓積做了詳細分析[7-8]。到目前為止,國內(nèi)尚未見對15月齡以上的比格犬的紅細胞壓積、脆性進行測定的報道。本次測定選取不同年齡段健康比格犬,對紅細胞壓積、脆性的數(shù)值進行準確檢測,并分析其變化規(guī)律。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 3月齡、6月齡、8月齡、1 ～8 歲齡健康比格犬(Covance中體型)120只,3月齡組20只,其余每個年齡組10只,體重相近,雌雄各半,均由青島博隆實驗動物有限公司提供。根據(jù)生長階段分為幼年犬(3月齡)、育成犬(6～8月齡)、成年犬(1～6歲齡)、老年犬(7～8歲齡)4組。

1.1.2儀器與試劑 EDTA-K2抗凝管、肝素鈉抗凝管,山東天愛醫(yī)療器械有限公司;Junior Vet 5血細胞分析儀,蘭橋康泰醫(yī)學科技有限公司;318C+酶標儀,上海沛歐分析儀器有限公司;細胞培養(yǎng)板,Costar公司;自配置梯度鹽水。

1.2方法

1.2.1配置梯度鹽水 鹽水梯度見表1。

1.2.2樣品采集 每只比格犬在相同時間段于前肢內(nèi)側(cè)靜脈處采集血液,采集4 mL分別放入兩種抗凝管,各2 mL,均在6 h內(nèi)處理樣品。

1.2.3樣品的測定 將EDTA-K2抗凝管內(nèi)的血液輕輕混勻,利用血細胞分析儀測定紅細胞壓積;將各個梯度的鹽水分別依次加入5 mL離心管中,每管2.5 mL,并將生理鹽水與蒸餾水各2.5 mL分別加入額外的兩個5 mL離心管中做陰性對照與陽性對照,每組均設(shè)陰性對照與陽性對照,然后將肝素鈉抗凝管內(nèi)的血液輕輕混勻,向離心管中依次加入50 μL血液,輕輕混勻。在室溫下靜置1 h后,用移液槍小心的吸取每個離心管液面的液體100 μL,加入細胞培養(yǎng)板中,放入酶標儀總測定在570 nm波長下的吸光度值[9]。將各孔中液體在570 nm時的吸光度值(OD值)進行記錄。液體中血紅蛋白濃度越高,OD值越大,當紅細胞完全溶解時,梯度鹽水間OD值趨于穩(wěn)定并近似于陽性對照。OD值開始升高時為開始溶血,其NaCl濃度為最小抵抗值,OD值趨于穩(wěn)定并近似于陽性對照時為完全溶血,其最高NaCl濃度為最大抵抗值,記錄最小抵抗值和最大抵抗值的鹽水濃度。

表1　鹽水梯度

1.2.4統(tǒng)計分析 采用 SPSS22軟件進行統(tǒng)計分析。

2　結(jié)果

2.1紅細胞壓積結(jié)果分析 比格犬的紅細胞壓積隨著年齡的增長,呈現(xiàn)先增長,再降低的情況;但不同性別比格犬的紅細胞壓積變化又存在一定差異,公犬的紅細胞壓積在4歲前隨年齡逐漸上升,于4～6歲時達到最大值并呈現(xiàn)穩(wěn)定狀態(tài),隨后于7歲時降低;母犬的紅細胞壓積在5歲前隨年齡逐步上升,于5歲時達到最大值,隨后下降(見中插彩版圖1)。

將所有比格犬按生長階段、性別分組,分別對相應(yīng)分組犬的紅細胞壓積進行獨立樣本t檢驗和單因素方差分析(表3)。結(jié)果顯示,成年犬紅細胞壓積分別大于幼年犬,差異顯著(P＜0.01,F=4.102,df=68)、育成犬,差異顯著(P＜ 0.01,F=0.354,df=78)、老年犬,差異顯著(P＜ 0.05,F=0.069,df=78);老年犬紅細胞壓積分別大于幼年犬,差異顯著(P＜0.01,F=4.869,df=28)、育成犬,差異顯著(P＜0.01,F=0.563,df=38);育成犬紅細胞壓積大于幼年犬,差異顯著(P＜0.01,F=3.42,df=28);成年公犬紅細胞壓積大于母犬,差異顯著(P＜0.05,F=2.047,df=58),其他各組內(nèi)公、母犬之間紅細胞壓積無顯著差異(表2)。

表2　不同生長階段及性別紅細胞壓積的參考值

2.2紅細胞脆性結(jié)果分析 紅細胞脆性與年齡之間暫無變化規(guī)律可循。將所有比格犬按生長階段、性別分組,分別對相應(yīng)分組犬的紅細胞脆性進行獨立樣本t檢驗和單因素方差分析(表5)。結(jié)果顯示,紅細胞脆性幼年犬與育成犬的最大抵抗值差異顯著(P＜0.05,F=0.662,df=28),最小抵抗值差異不顯著,幼年犬與成年犬最小抵抗值差異顯著(P＜0.05,F=1.756,df=68),最大抵抗值差異不顯著,幼年犬與老年犬最小抵抗值和最大抵抗值差異都不顯著;育成犬與成年犬的最大抵抗值與最小抵抗值差異都不顯著;育成犬與老年犬的最大抵抗值差異顯著(P＜ 0.05,F=4.857,df=34.299),最小抵抗值差異不顯著;成年犬與老年犬的最大抵抗值差異顯著(P＜0.05,F=0.055,df=78),最小抵抗值差異不顯著;成年公、母犬之間紅細胞脆性最大抵抗值差異顯著(P＜0.05,F=0.031,df=58),最小抵抗值差異不顯著;其余各組公母犬紅細胞脆性差異不顯著(表3)。

表3　不同生長階段及性別紅細胞脆性的參考值

3　討論

不同種系、飼養(yǎng)環(huán)境、設(shè)施的變化會直接影響到比格犬的生理指標,使比格犬的基本生物學數(shù)據(jù)存在一定的差別[10]。隋麗華、王冬平等人檢測某封閉群比格犬紅細胞壓積的結(jié)果顯示[7-8],6月齡、8月齡比格犬的紅細胞壓積分別為34.43±8.16(%)和39.19±14.18(%),4～8月齡的比格犬紅細胞壓積隨著年齡增長逐漸升高;本次測定發(fā)現(xiàn)6月齡和8月齡比格犬的紅細胞壓積分別為42.35±2.80(%)和45.40 ±1.81(%),雖然相似月齡的紅細胞壓積存在差異,但其變化規(guī)律與二人數(shù)值的變化規(guī)律相符。成年后比格犬紅細胞壓積的數(shù)據(jù)較少,暫未發(fā)現(xiàn)對比的數(shù)值。

成年犬的紅細胞壓積大于幼年犬、育成犬與老年犬的情況,與人類紅細胞壓積參考值的變化情況相似[11-13]。母犬的紅細胞壓積在6歲齡時下降,公犬在7歲齡時下降,應(yīng)與隨著年齡的增長,激素水平、身體機能下降有關(guān)。有研究表明,雄激素有刺激紅細胞生成素(EPO)的合成與釋放的作用,也有改善骨髓對EPO的反應(yīng)性的作用。EPO是一種物理化學性質(zhì)較穩(wěn)定的糖蛋白,與紅系祖細胞(CFUE)受體結(jié)合后能使其增值分化,并顯著減慢CFUE脫氧核糖核酸(DNA)降解速率,抑制CFU-E凋亡,CFU-E能促進紅細胞成熟,是紅系造血的主要調(diào)節(jié)因子[13]。紅細胞壓積在公、母犬幼年時無明顯差異,但成年時公犬大于母犬,與相關(guān)研究的情況相符。

本次測定不但檢測了幼年犬和育成犬的紅細胞壓積,還檢測了成年犬與老年犬的紅細胞壓積以及各生長階段的紅細胞脆性,并分析了其變化情況,豐富了動物實驗的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

參考文獻: