蘇瑋瑋,趙攀攀,丁赫楠,張秀華,么 亮,呂曉研,張樹成,武 華

[華威特(江蘇)生物制藥有限公司,江蘇 泰州 225300]

豬瘟(CSF)是由豬瘟病毒(CSFV)引起的一種高度接觸性傳染病。豬瘟病毒為黃病毒科瘟病毒屬成員,病毒粒子呈球形,核衣殼為二十面體對稱,為有囊膜的單股正鏈RNA病毒。急性豬瘟特征是急性敗血癥、實(shí)質(zhì)器官出血、壞死和梗死;慢性豬瘟呈現(xiàn)纖維素性壞死性腸炎,后期常繼發(fā)副傷寒及巴氏桿菌病。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須報告的動物疫病,我國將其列為一類動物疫病[1-2]。1833年美國俄亥俄州首次發(fā)現(xiàn)了豬瘟[3],1822年法國也有豬瘟暴發(fā)報告[4],1866年以前豬瘟在歐洲和美國廣泛流行。日本首次暴發(fā)豬瘟是在1888年,隨后是中國和印度。20世紀(jì)末豬瘟在全球許多地區(qū)仍然普遍流行,目前該病在美洲、歐洲、亞洲等國家和地區(qū)呈現(xiàn)復(fù)發(fā)趨勢,一些已宣布消滅豬瘟的國家又見豬瘟復(fù)發(fā)的報道[5]。在我國雖然采取強(qiáng)制免疫措施,但該病仍在全國范圍之內(nèi)不間斷的流行。

為了控制該病,接種安全和高效的疫苗十分重要。目前應(yīng)用最廣泛的是豬瘟弱毒活疫苗,毒株包括中國豬瘟兔化弱毒疫苗(C株)、日本GPE-疫苗和法國的 Thiverval疫苗。國內(nèi)動物疫苗生產(chǎn)企業(yè)均采用的是豬瘟兔化弱毒疫苗(C株),生產(chǎn)工藝上大多還是采用傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶方法,其缺點(diǎn)是費(fèi)時費(fèi)力、易污染、不穩(wěn)定、抗原批間差大[6]。近年來,懸浮培養(yǎng)技術(shù)已在口蹄疫疫苗和禽流感疫苗中得到大規(guī)模應(yīng)用,在CSFV培養(yǎng)中應(yīng)用還不多,但采用微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)CSFV疫苗可以克服上述傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶方法的不足。本研究應(yīng)用生物反應(yīng)器微載體懸浮培養(yǎng)BT細(xì)胞生產(chǎn)CSFV抗原,使用FAID50(半數(shù)熒光抗體感染劑量)方法測定病毒含量,試驗(yàn)結(jié)果報告如下。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞與病毒 BT細(xì)胞(F11代),由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保管和供應(yīng);毒種CSFV(F12代)由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保管和供應(yīng)。

1.2培養(yǎng)基及血清 MEM培養(yǎng)基,購自美國Hyclone公司;新生牛血清,購自蘭州榮曄公司。

1.3抗體 抗豬瘟單克隆抗體,由華威特(江蘇)生物制藥有限公司提供;驢抗鼠熒光抗體,購自美國NOVEX公司。

1.4微載體 Cytodex 1,購自GE Healthcare Inc.

1.5生物反應(yīng)器 BioFlo 310型生物反應(yīng)器,最大工作體積分別為2 L和10 L,購自美國NBS生物工程公司。

1.6微載體預(yù)處理 取微載體(Cytodex 1),每克微載體用50 mL PBS(pH值7.2)緩沖液泡脹,更換PBS 3次后浸泡過夜,次日121℃滅菌30 min,更換無菌的新鮮培養(yǎng)基浸泡,備用[8]。

1.7轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng) 將解凍的BT細(xì)胞1 000 r/min離心15 min后,除去上清加入含8%新生牛血清的MEM培養(yǎng)基重懸并接種至175 cm2培養(yǎng)瓶中,置37℃、含5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長成致密單層時,用0.25%胰酶/EDTA消化,傳代至15 L轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)。

1.8確定BT細(xì)胞最佳接種密度 將處理好的微載體按照3 g/L比例加入到2 L含8%新生牛血清的MEM培養(yǎng)基中,而后無菌加入到2 L生物反應(yīng)器中。 分別按1.0 ×105個/mg、1.5 ×105個/mg、2.0 ×105個/mg、2.5 ×105個/mg 細(xì)胞密度接種,設(shè)置生物反應(yīng)器參數(shù):溫度37℃、pH值7.2、溶氧50%、轉(zhuǎn)速45 r/min。培養(yǎng)24 h后取樣,然后每12 h取樣1次,鏡下觀察細(xì)胞生長情況并計(jì)數(shù)。

1.9BT細(xì)胞的微載體懸浮培養(yǎng)放大工藝驗(yàn)證采用確定的細(xì)胞培養(yǎng)工藝,用2 L反應(yīng)器培養(yǎng)3批BT細(xì)胞,培養(yǎng)體積2 L,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到4.0×106個/mL以上時,用0.25%胰酶/EDTA 消化,按1∶5比例放大至10 L生物反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)。

1.10確定病毒最佳接種劑量 將處理好的微載體按照3 g/L濃度加入到2 L含8%新生牛血清的MEM培養(yǎng)基中,而后無菌加入到2 L生物反應(yīng)器中,按1.5×105個/mg細(xì)胞密度接種。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到3.0×106個/mL時,更換含2% 新生牛血清的維持液,將 CSFV 分別按感染復(fù)數(shù)(MOI)0.2、0.5、0.8、1.2接種。接種后第5天開始收獲培養(yǎng)上清液并留樣10 mL用于測定病毒含量,以后每隔4 d收獲并換液1次,連續(xù)收獲5次。

1.11微載體懸浮培養(yǎng)工藝與轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝比較

1.11.1微載體懸浮培養(yǎng)工藝 采用確定的細(xì)胞培養(yǎng)工藝,用2 L反應(yīng)器培養(yǎng)BT細(xì)胞,培養(yǎng)體積2 L,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到4.0×106個/mL以上時,用0.25%胰酶/EDTA消化,按1∶5比例放大至10 L生物反應(yīng)器中。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到3.0×106個/mL時,更換含2%新生牛血清的維持液,將CSFV按MOI為0.5接種。接種后第5天開始收獲培養(yǎng)上清液并留樣10 mL用于測定病毒含量,以后每隔4 d收獲并換液1次,連續(xù)收獲5次。

1.11.2轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝 使用15 L轉(zhuǎn)瓶,當(dāng)細(xì)胞鋪滿單層時,更換含2%新生牛血清的維持液,將CSFV按MOI為 0.5接種,每瓶加入1 000 mL維持液。接種后第5天開始收獲培養(yǎng)上清液并留樣10 mL用于病毒含量測定,以后每隔4 d收獲并換液1次,連續(xù)收獲5次。

1.12病毒含量測定 病毒含量測定前2 d在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中繁殖BT細(xì)胞單層,當(dāng)細(xì)胞單層達(dá)到板孔面積70%～80%時,用PBS洗滌細(xì)胞單層2次,將病毒樣品10倍倍比稀釋,將每個稀釋樣品加到細(xì)胞培養(yǎng)板的6個孔中,每孔100 μL,同時設(shè)陰性對照。細(xì)胞培養(yǎng)4 d后進(jìn)行熒光染色FAID50,在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞,有特異性熒光的孔判定為陽性,無特異性熒光的孔判定為陰性,結(jié)果用Spearman-Karber方法計(jì)算出FAID50病毒含量[8]。

2　結(jié)果

2.1BT細(xì)胞最佳接種密度 采用2 L生物反應(yīng)器,分別按 1.0 × 105個/mg、1.5 × 105個/mg、2.0 ×105個/mg、2.5 ×105個/mg細(xì)胞密度接種,從圖 1 細(xì)胞生長曲線可知,由于接種量不同,細(xì)胞生長密度差異明顯。當(dāng)起始接種密度為1.0×105個/mg時,細(xì)胞生長緩慢,培養(yǎng)時間長且最高細(xì)胞生長密度相對較低。當(dāng)起始接種密度為2.0×105/mg和2.5×105個/mg時,細(xì)胞覆蓋微載體面積相對快,但細(xì)胞死亡率高。起始接種密度為1.5×105/mg時,細(xì)胞培養(yǎng)72 h即可覆蓋微載體面積的70% ～80%,且細(xì)胞狀態(tài)良好。所以確定BT細(xì)胞最佳接種密度為1.5 ×105個/mg。

圖1　BT細(xì)胞接種密度與生長細(xì)胞密度的關(guān)系

2.2BT細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)放大工藝驗(yàn)證 以2 L生物反應(yīng)器為種子反應(yīng)器,經(jīng)過4 d培養(yǎng),BT細(xì)胞密度均可達(dá)到 4.0×106個/mL(第 1批:4.2×106個/mL、第2 批:4.1 ×106個/mL、第 3 批:4.5 ×106個/mL)。用胰酶消化法消化細(xì)胞,將消化的細(xì)胞作為種子細(xì)胞與滅菌的新鮮微載體吸附后繼續(xù)在10 L生物反應(yīng)器放大培養(yǎng)。經(jīng)過3次重復(fù)試驗(yàn),放大到10 L生物反應(yīng)器培養(yǎng)的細(xì)胞其密度在96 h時均可達(dá)到4.0×106/mL以上(見圖2)。

圖2　3批BT細(xì)胞10 L生物反應(yīng)器微載體懸浮培養(yǎng)結(jié)果

2.3確定病毒最佳接種劑量 當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到3.0×106個/mL時,CSFV 感染復(fù)數(shù)(MOI)分別按0.2、0.5、0.8、1.2 接種。 由圖 3 可知,當(dāng)按 MOI為0.2接種時,收獲的抗原病毒含量較低,說明接種的病毒量較少。 當(dāng) MOI為 0.5、0.8、1.2 時,收獲的抗原病毒含量均≥106.8FAID50/mL,但相比較MOI為0.5時,抗原病毒含量最高,且初始接種量最低,所以確定最佳接種MOI為0.5。

圖3　CSFV生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)方式不同接種劑量與病毒含量的對比

2.4微載體懸浮培養(yǎng)工藝與轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝比較

轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)和微載體懸浮培養(yǎng)的BT細(xì)胞,均接種病毒后第5天開始第1次收毒,此后每隔4 d進(jìn)行再次收獲換液,連續(xù)收獲5次。對比收獲的抗原病毒含量,結(jié)果表明,微載體懸浮培養(yǎng)的CSFV病毒含量約是轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)的15倍(見圖4),生物反應(yīng)器收獲1 L病毒液的產(chǎn)量相當(dāng)于15個轉(zhuǎn)瓶的產(chǎn)量。

圖4　CSFV微載體懸浮培養(yǎng)與轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)生產(chǎn)方式抗原病毒含量對比

3　討論

近年來的國內(nèi)調(diào)查和監(jiān)測結(jié)果顯示,非典型豬瘟特別常見,發(fā)病率和死亡率雖然偏低,但病程延長,多存在隱性感染和持續(xù)感染,造成CSFV在豬群內(nèi)水平傳播、垂直傳播,同時會繼發(fā)其他細(xì)菌類疾病[9]。接種疫苗仍然是預(yù)防豬瘟的最佳手段,所以提升豬瘟疫苗質(zhì)量至關(guān)重要。中國的豬瘟兔化弱毒疫苗(C株)是國際上公認(rèn)的安全性和免疫原性最好的疫苗株[10],國內(nèi)相對應(yīng)的主要產(chǎn)品有豬瘟活疫苗(細(xì)胞源)、豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)、豬瘟活疫苗(脾淋源)、豬瘟活疫苗(兔源)。根據(jù)2016年國內(nèi)豬瘟活疫苗批簽發(fā)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示,年累計(jì)批簽發(fā)豬瘟弱毒活疫苗約34.9億頭份,其中豬瘟活疫苗(細(xì)胞源)占48.02%;豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)占24.59%;豬瘟活疫苗(脾淋源)占 20.77%;豬瘟活疫苗(兔源)占 6.62%。其中細(xì)胞源的產(chǎn)品占72.61%,仍是市場主導(dǎo),但其質(zhì)量決定因素在于抗原的有效病毒含量及抗原與成品的效力評定方法的可靠性。

本試驗(yàn)基于BT細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝優(yōu)化的基礎(chǔ)上開展CSFV的病毒懸浮培養(yǎng)工藝優(yōu)化及與轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝的對比。試驗(yàn)結(jié)果顯示,在3 g/L微載體濃度下,采用1.5×105個/mg的細(xì)胞初始接種密度,細(xì)胞培養(yǎng)72 h可獲得最佳細(xì)胞密度;MOI為0.5時CSFV抗原從第1次收獲到第5次收獲病毒含量均高于106.8FAID50/mL;細(xì)胞從2 L到10 L生物反應(yīng)器的5倍消化放大工藝驗(yàn)證獲得比較穩(wěn)定的試驗(yàn)結(jié)果;懸浮培養(yǎng)工藝增殖的CSFV病毒含量約是轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝的15倍,且相比轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝批間穩(wěn)定。以上結(jié)果說明,CSFV可實(shí)現(xiàn)生物反應(yīng)器規(guī)模化生產(chǎn),且相比轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝有明顯優(yōu)勢。試驗(yàn)中的CSFV均采用FAID50(半數(shù)熒光抗體感染劑量)進(jìn)行病毒含量測定。FAID50測定是指應(yīng)用免疫熒光方法對病毒半數(shù)組織感染量進(jìn)行測定的一種方法,中華人民共和國第2270號公告已在《高致病性豬繁殖與呼吸綜合征、豬瘟二聯(lián)活疫苗(TJM-F92株+C株)制造及檢驗(yàn)試行規(guī)程》中確認(rèn)FAID50為豬瘟疫苗效力檢驗(yàn)方法之一,使本次試驗(yàn)的CFSV的病毒含量數(shù)據(jù)更加精準(zhǔn)可靠。

目前動物細(xì)胞大規(guī)模懸浮培養(yǎng)已成為生物制藥領(lǐng)域最重要的關(guān)鍵技術(shù)之一,是國內(nèi)外生物制品企業(yè)疫苗工藝方向的首選。本次試驗(yàn)采用的是微載體懸浮培養(yǎng)工藝,相對轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)是表面積大、細(xì)胞產(chǎn)量高、質(zhì)量均一、病毒效價高、污染機(jī)會少[11],并且培養(yǎng)一次的收獲體積大于多次轉(zhuǎn)瓶的生產(chǎn)量,其結(jié)果是提高了生產(chǎn)效率,確保了產(chǎn)品的均一性與穩(wěn)定性。但微載體懸浮培養(yǎng)與純懸浮培養(yǎng)相比,成本較高,細(xì)胞消化放大工藝難度大,目前國內(nèi)還沒有CSFV純懸浮方面研究的報道。商業(yè)化豬瘟細(xì)胞苗多采用牛睪丸原代細(xì)胞、豬睪丸傳代細(xì)胞(ST)轉(zhuǎn)瓶工藝,CSFV微載體懸浮工藝的疫苗已有科研單位處于新獸藥申報階段,希望本次試驗(yàn)數(shù)據(jù)能為后續(xù)的豬瘟疫苗工藝提升奠定基礎(chǔ)。