廖潔丹,李智麗,張濟(jì)培,陳建紅,楊 鴻

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 佛山 528225)

氟喹諾酮類(fluoroquinolones,FQs)是一類人工合成的抗菌藥物,因其吸收好、組織濃度高、與其他藥物交叉耐用性少等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用獸醫(yī)臨床和水產(chǎn)養(yǎng)殖。由于人們對(duì)FQs藥物的不合理使用以及不遵守該類藥物的休藥期,食品中殘留低濃度的藥物誘導(dǎo)人類致病菌耐藥性逐年增加,FQs在動(dòng)物性食品中的殘留問題引起廣泛關(guān)注,國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道了動(dòng)物性食品中獸藥殘留分析方法[1-2]。目前,牛奶中獸藥殘留的檢測(cè)方法主要有微生物檢測(cè)法[3]、分光光度法[4]、酶聯(lián)免疫檢測(cè)法[5-6]、膠體金免疫層析法[7]、高效液相色譜法[8-9]、高效液相色譜—質(zhì)譜串聯(lián)法[10]、毛細(xì)管電泳法[11]、適配體傳感器檢測(cè)法[12]等。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《牛奶中氟喹諾酮類藥物多殘留的測(cè)定(GB29692-2013)》由于需專業(yè)的操作人員,且受設(shè)備條件、實(shí)驗(yàn)成本和操作繁瑣等限制,使其在國(guó)內(nèi)較難普及[13]。本研究旨在建立一種方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高,同時(shí)滿足檢測(cè)牛奶中4種氟喹諾酮類藥物殘留的檢測(cè)方法。

1　材料與方法

1.1儀器與設(shè)備 高效液相色譜儀(Agilent 1100)、電子分析天平、離心機(jī)、微型混合器、多功能振蕩器、微量移液器等。

1.2試劑 恩諾沙星對(duì)照品(含量100.0%)、鹽酸環(huán)丙沙星對(duì)照品(含量99.8%)、沙拉沙星對(duì)照品(含量99.6%),購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;二氟沙星原料藥(含量100.6%),購(gòu)自廣州惠華有限公司;檸檬酸、乙酸銨、三乙胺、甲醇、正己烷(國(guó)產(chǎn)分析純);乙腈(色譜純,Fisher Scientific公司);提取液為65 μL磷酸 +4 mL甲醇溶液;流動(dòng)相:準(zhǔn)確稱取10.55 g檸檬酸和7.86 g乙酸銨,用去離子水溶解,加水稀釋至1 000 mL,然后加三乙胺調(diào)pH值至2.4即為水相,水相與乙腈(85∶15,V/V)。

1.3溶液配置

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 稱取恩諾沙星對(duì)照品0.0100 g和沙拉沙星對(duì)照品0.0110 g,分別用10%醋酸溶解后甲醇定容至10 mL;稱取鹽酸環(huán)丙沙星對(duì)照品0.0116 g和鹽酸二氟沙星原料藥0.0099 g,分別用超純水溶解后甲醇定容至10 mL;分別制得終濃度為1 mg/mL的4種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.3.2混合標(biāo)準(zhǔn)工作液 取以上4種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各1 mL,用甲醇稀釋并定容制備終濃度為100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液Ⅰ。取1 mL標(biāo)準(zhǔn)工作液Ⅰ,用甲醇稀釋并定容制備終濃度為10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液Ⅱ。取標(biāo)準(zhǔn)工作液Ⅱ,用甲醇稀釋制備0.01 μg/mL、0.02 μg/mL、0.05 μg/mL、0.10 μg/mL、0.20 μg/mL、0.50 μg/mL、1.00 μg/mL 7 個(gè)系列濃度的混合氟喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)工作液Ⅲ,存放于4℃冰箱。

1.4色譜條件 色譜柱 Hypersil BDS-C18(4.6 mm ×250 mm,5 μm);熒光檢測(cè)器,激發(fā)波長(zhǎng)(λex=278 nm),發(fā)射波長(zhǎng)(λem=465 nm),流動(dòng)相為 0.05 mol/L檸檬酸/0.1 mol/L乙酸銨—乙腈(85∶15,V/V),使用前先用微孔濾膜過濾;柱溫:40℃,流速1.0 mL/min,進(jìn)樣量 30 μL。

1.5乳樣品預(yù)處理 準(zhǔn)確吸取1 mL乳樣品于15 mL塑料離心管中,加入100 μL混合氟喹諾酮的系列濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液Ⅲ,旋渦混合器上混合30 s,靜置30 min。加入65 μL磷酸+4 mL甲醇溶液,旋渦30 s以上;水平振蕩30 min,靜置5 min。6 000 r/min離心6 min,將上清移至15 mL塑料離心管,殘?jiān)?5 μL磷酸和4 mL甲醇溶液再次提取后合并上清。于上清中加入4 mL正己烷,旋渦混勻后靜置5 min至分層清晰,將上層棄掉。剩余物78℃水浴,空氣吹干。上述殘?jiān)? mL流動(dòng)相溶解并移至1.5 mL EP 管,12 000 r/min 離心6 min。 上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾后上機(jī)檢測(cè)。

1.6標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 準(zhǔn)確吸取1 mL空白乳樣品置于8支塑料離心管中,取100 μL共7個(gè)系列濃度的混合氟喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)工作液Ⅲ,旋渦混合30 s,靜置30 min,其中第1管不加藥物對(duì)照。按1.5方法預(yù)處理,按1.4色譜條件從低濃度到高濃度測(cè)定,將測(cè)得的FQs藥物的色譜峰面積(A)與相對(duì)應(yīng)的藥物濃度(C)作直線回歸,求得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的線性范圍。

1.7檢測(cè)限及定量限 取牛奶空白乳樣品進(jìn)行添加回收試驗(yàn),按照1.5乳樣品前處理方法處理后進(jìn)行HPLC分析。以信噪比法(S/N≥10),且在該添加水平的回收率和變異系數(shù)均滿足殘留分析要求的最小濃度作為定量限(limit of quantity,LOQ);以信噪比法(S/N=3)作為藥物的檢測(cè)限(limit of detection,LOD),分別確定4種氟喹諾酮類藥物的定量限和檢測(cè)限。

1.8準(zhǔn)確度和精密度 在1 mL空白乳汁樣品中分別添加 5 個(gè)不同濃度(0.01 μg/mL、0.05 μg/mL、0.10 μg/mL、0.50 μg/mL、1.00 μg/mL)的 FQs藥物標(biāo)準(zhǔn)工作液Ⅲ,按1.5乳樣品處理方法,1.4色譜分析。每個(gè)濃度做5個(gè)平行樣品,同時(shí)進(jìn)行空白對(duì)照,共做4個(gè)批次(日間),計(jì)算每個(gè)樣品的回收率、批內(nèi)和批間的變異系數(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 添加氟喹諾酮系列標(biāo)準(zhǔn)工作液Ⅲ的乳樣品按1.5方法預(yù)處理,按1.4色譜條件測(cè)定,乳樣品中4種FQs藥物與樣品中其他成分有效分離。將FQs藥物的色譜峰面積(A)與相對(duì)應(yīng)的藥物濃度(C)作直線回歸,求得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的線性范圍為0.01～1.00 μg/mL內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(R=0.999 9),結(jié)果見圖1。

2.2色譜圖 空白乳樣品按1.5方法預(yù)處理,按1.4色譜條件檢測(cè)。結(jié)果表明,空白乳樣品對(duì)4種氟喹諾酮類藥物的對(duì)應(yīng)保留時(shí)間處所測(cè)的分析物均無干擾。圖2～圖4分別是空白乳樣品、FQs藥物混合標(biāo)準(zhǔn)品(0.10 μg/mL)及添加 FQs藥物乳樣品(0.10 μg/mL)的色譜圖。本試驗(yàn)在1 L流動(dòng)相中加入1 mL三乙胺調(diào)pH值至2.4,消除FQs藥物的兩性化合物中硅羥基的影響,抑制其解離,改善峰形。由色譜圖可見,預(yù)處理后乳樣品各組分分離度較佳,色譜峰形好且保留時(shí)間合理,出峰時(shí)間分別為環(huán)丙沙星 6.621 min、恩諾沙星9.684 min、沙拉沙星 12.883 min、二氟沙星 15.731 min。

本文利用常規(guī)氣象觀測(cè)資料、NCEP/FNL 1°×1°逐6 h再分析資料等,結(jié)合中尺度數(shù)值模式WRF對(duì)2016年3月16—17日發(fā)生在華東沿海的一次大范圍平流霧成因進(jìn)行數(shù)值模擬研究,主要結(jié)論如下:

圖2　空白乳樣品色譜圖

圖3　FQs標(biāo)準(zhǔn)品(100 ng/mL)色譜圖

圖4　牛奶中添加FQs(100 ng/mL)色譜圖

2.3檢測(cè)限及定量限 按照S/N=3計(jì)算,環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星在牛奶中的檢測(cè)限均為5 ng/mL,二氟沙星在牛奶中的檢測(cè)限為8 ng/mL。在空白乳汁樣品中分別添加5個(gè)濃度(0.01 μg/mL、0.05 μg/mL、0.10 μg/mL、0.50 μg/mL、1.00 μg/mL)的FQs藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液,每種濃度5個(gè)樣品,按1.5乳樣品處理后HPLC檢測(cè)。結(jié)果顯示,牛奶中4種FQs藥物的添加濃度為10 ng/mL時(shí),S/N≥10,且回收率均大于87%,變異系數(shù)小9.84%。因此,環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星定量限均為10 ng/mL。

2.4準(zhǔn)確度和精密度 采用添加法選取5種不同添加濃度(0.01,0.05,0.10,0.50,1.00 μg/mL),以上5種濃度包含4種FQs藥物殘留檢測(cè)的要求。每種濃度5個(gè)樣品,重復(fù)4批次。測(cè)定結(jié)果顯示,牛奶乳樣品中環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星的回收率分別為80% ～92%,77% ～91%,81% ～93%,78% ～88%。本方法的批內(nèi)、批間的變異系數(shù)均值分別為5.29%和7.83%。結(jié)果表明,本研究建立的檢測(cè)方法準(zhǔn)確度和精密度良好。

3　討論

3.1色譜條件的優(yōu)化 色譜分析法是檢測(cè)牛奶中獸藥殘留的常用方法[4],國(guó)內(nèi)學(xué)者也對(duì)牛奶中FQs藥物多殘留檢測(cè)進(jìn)行相關(guān)研究報(bào)道[13-15]。由于FQs在食品和環(huán)境中殘留量極低,建立高靈敏度和準(zhǔn)確度的分析方法是檢測(cè)的關(guān)鍵,選擇合適的色譜操作條件至關(guān)重要。柱溫、流動(dòng)相組份的比例以及流速等都直接影響柱壓,從而改變了樣品組份的保留時(shí)間。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)室溫條件下色譜峰形欠佳且分離度不完全,40℃ 柱溫效果最佳。因?yàn)镕Qs藥物在酸性條件下熒光強(qiáng)度較高,且出峰時(shí)間對(duì)乙腈敏感,本研究的流動(dòng)相水相選用0.05 mol/L檸檬酸-0.1 mol/L乙酸銨并用三乙胺調(diào)整pH值為2.4改善峰形,嘗試14%,15%,16%,17%,18%乙腈濃度避開樣品中的干擾峰,乙腈比例加大藥物出峰時(shí)間前移。結(jié)果表明,選用上述水相和15%乙腈為有機(jī)相可在17 min內(nèi)完成樣品中4種氟喹諾酮類藥物殘留檢測(cè),與楊勇等[13]報(bào)道的測(cè)定牛奶中6種氟喹諾酮類藥物殘留方法比較,縮短了樣品檢測(cè)時(shí)間且分離度最佳。此外,為了避免各組織樣品提取液中的微量蛋白、脂肪等物質(zhì)縮短色譜柱的壽命,我們?cè)谏V分析柱前加C18保護(hù)柱進(jìn)行保護(hù)。

3.2樣品前處理方法的選擇 牛奶中含有大量的脂類、蛋白質(zhì)等干擾物質(zhì)影響色譜分離和檢測(cè),樣品前處理方法的選擇與藥物殘留的種類、檢測(cè)手段以及樣品基質(zhì)復(fù)雜程度有關(guān)[16],是檢測(cè)分析的關(guān)鍵步驟[17]。迄今為止,沉淀法、液液萃取和固相萃取[17-18]是較為常用的樣品前處理技術(shù),固相微萃取和分子印跡固相萃取聯(lián)用[19]、基質(zhì)固相分散萃取[17]、超臨界流體萃取[20]、Qu ECh ERS技術(shù)[17,21-23]在藥物多殘留分析方面的應(yīng)用范圍也逐漸擴(kuò)大。近年來,濁點(diǎn)萃取(Cloud Point Extraction,CPE)技術(shù)也逐步應(yīng)用于牛奶中FQs藥物的殘留檢測(cè)[24-25]。本研究曾用乙腈-10%三氯乙酸(3∶7,V/V)為提取液,通過SPE凈化后濃縮上樣,結(jié)果發(fā)現(xiàn)回收率和定量限與磷酸-甲醇提取液提取效果類似,但因SPE柱凈化成本較高,操作者熟練程度會(huì)影響樣品的回收率以及變異系數(shù),最終選擇了后者作為前處理方法。本研究也在提取液的用量以及提取次數(shù)比較其回收率,結(jié)果表明,提取液為3 mL時(shí)回收率偏低,4 mL與6 mL無明顯差別,提取兩次的回收率較高,最終選用了65 μL磷酸與4 mL甲醇提取兩次后揮干定容。

本試驗(yàn)建立的氟喹諾酮類藥物多殘留檢測(cè)方法比已報(bào)道的牛奶中FQs藥物殘留檢測(cè)相比較[14,26]具更高的準(zhǔn)確度和精密度。因此,本試驗(yàn)建立的殘留檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、準(zhǔn)確度和精密度好,適用于牛奶中4種氟喹諾酮類藥物殘留檢測(cè)。