盧 揚(yáng)， 劉永翔， 李 俊， 王 輝， 陳朝軍， 陳中愛， 唐健波， 劉 輝

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，貴州貴陽 550006)

苦蕎是一種蓼科蕎麥屬植物，因其有高含量的淀粉(71.6%～72.61%)以及抗氧化物質(zhì)黃酮，兼具藥食兩用的效果?？嗍w的栽培主要集中在我國西南地區(qū)，包括四川、云南、貴州等省(區(qū))，四川省的涼山州被認(rèn)為是苦蕎種植的發(fā)源之地，是當(dāng)前世界上苦蕎麥分布最集中、種植面積最大的產(chǎn)區(qū)[1]。貴州省威寧縣地處貴州西北部，高海拔、苦寒環(huán)境適合苦蕎的種植，播種面積達(dá)5.33萬hm2以上，是貴州省重要的苦蕎生產(chǎn)基地，也是國內(nèi)苦蕎生產(chǎn)極其重要的原料供應(yīng)基地[2]。

由于苦蕎豐富的氨基酸成分，以及具有降血壓、降血脂、抗氧化作用的黃酮類物質(zhì)[3-4]，已經(jīng)被開發(fā)成形式多樣的產(chǎn)品，包括苦蕎茶、苦蕎面條、苦蕎沙琪瑪?shù)?。貴州省威寧縣的苦蕎加工可追溯到600多年前，威寧縣生產(chǎn)的蕎酥成為明朝開國皇帝朱元璋的御用貢品。經(jīng)過多年的發(fā)展和工藝改進(jìn)，目前貴州省威寧縣的苦蕎加工產(chǎn)品有蕎酥、苦蕎米、苦蕎酒、苦蕎飯等。而經(jīng)過特殊工藝精制而成的苦蕎粉，是面條、饅頭、餃子、糕點(diǎn)等食品的添加原料，且由于工藝不復(fù)雜、營養(yǎng)成分損失少等特點(diǎn)，非常適合“三高”人士作為主食食用。2014年，農(nóng)業(yè)部發(fā)布了NYT 894—2014《綠色食品 蕎麥及蕎麥粉》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)苦蕎粉中的總黃酮、水分、黃曲霉毒素、重金屬等提出了不同限度要求，其中總黃酮含量采用分光光度法以蕓香苷含量為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定。但是，單一成分的測(cè)定不能真實(shí)反映苦蕎粉中總黃酮含量的實(shí)際水平，達(dá)不到綜合評(píng)價(jià)的效果。本研究采用高效液相色譜法，同時(shí)測(cè)定3個(gè)不同部位的苦蕎粉(籽粒粉、芽苗菜粉、蕎麥葉粉)中3種主要黃酮類活性成分蕓香苷、槲皮素和山奈酚含量，并對(duì)其進(jìn)行比較研究，以期為苦蕎粉的應(yīng)用和質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

MS105DU電子天平，購自上海閔勝科技有限公司；LC-20A高效液相色譜儀，二極管陣列檢測(cè)器為SPD-M 20A，自動(dòng)進(jìn)樣器為SIL-20A，高壓輸液泵為LC-20A，購自日本島津公司。色譜柱為Agilent ZORBAX Extend-C18(5 μm，250 mm，4.6 mm)，購自美國Thermo公司；電熱恒溫水浴鍋(HWS-26)，購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；LGJ-10B真空冷凍干燥機(jī)，購自杭州創(chuàng)意真空冷凍干燥設(shè)備廠；CS-700超微粉碎機(jī)，購自廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司；UV-2450紫外可見分光光度計(jì)，購自日本島津公司。

蕓香苷、槲皮素、山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品，均購自中國醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。甲醇、乙酸為色譜純，購自貴州金摩爾化學(xué)有限公司。黔苦1號(hào)苦蕎種子、苦蕎芽苗菜由貴州省生物技術(shù)研究所提供，苦蕎葉片采自貴州省威寧縣試驗(yàn)地。

1.2 試驗(yàn)方法

本試驗(yàn)于2016年8—12月在貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及貴州省威寧縣農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)地完成?？嗍w品種為黔苦6號(hào)。

1.2.1 不同來源苦蕎粉的獲得 籽粒粉：參照濮生財(cái)?shù)鹊姆椒╗5]制得。芽苗菜粉的制作：選擇籽粒飽滿的蕎麥種子放在平皿中，加入適量清水浸泡10 h后，將種子轉(zhuǎn)移至另一個(gè)干燥平皿中放置16 h左右。然后將種子均勻地碼在鋪有紗布的帶孔塑料盆中，將紗布蓋上，每天撒適量清水于紗布上，使其保持濕潤。約7 d后，種子經(jīng)過發(fā)芽、生根、長葉，將上層紗布打開，維持10 h左右，使葉片可以獲得足夠光照，保證芽苗菜有充足的水分。在第13天左右，收集苦蕎芽苗菜500 g，于-30 ℃冰箱預(yù)冷凍12 h，然后在真空冷凍干燥器中將芽苗菜凍干，并用超微粉碎機(jī)將其打成粉末，即得芽苗菜苦蕎粉。蕎麥葉粉的制作：蕎麥葉片采自貴州省威寧縣試驗(yàn)地，制粉過程與芽苗菜粉制作過程一致。

1.2.2 色譜條件 色譜柱為Agilent ZORBAX Extend-C185 μm，4.6 mm×250 mm，流速為1.0 mL/min，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為20 μL，檢查波長為365 nm，流動(dòng)相A：甲醇，流動(dòng)相B：0.1% 乙酸，進(jìn)樣量為20 μL，根據(jù)表1進(jìn)行梯度洗脫。

表1 梯度洗脫程序

1.2.3 溶液樣品的制備 標(biāo)準(zhǔn)使用液的制備：分別精確稱取10 mg對(duì)照品蕓香苷、10 mg槲皮素、10 mg山奈酚于25 mL量瓶中，用甲醇定容，配成濃度分別為400 μg/mL的對(duì)照品貯備液。

分別量取5 mL蕓香苷、3 mL槲皮素、2 mL山奈酚的對(duì)照品貯備液于10 mL容量瓶中，分別制成蕓香苷、槲皮素、山萘酚濃度約為200、120、80 μg/mL的混合對(duì)照品使用液，然后用甲醇進(jìn)行稀釋，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，進(jìn)樣20 μL，進(jìn)行高效液相色譜(high performance liquid chromatography，簡稱HPLC)分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

供試樣品溶液制備：分別精確稱取苦蕎粉樣品約1 g，于85 ℃用90%甲醇索氏提取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮于100 mL量瓶中，加甲醇定容，取1 mL于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度。吸取上述樣品，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，進(jìn)樣20 μL，進(jìn)行色譜分析，用外標(biāo)法計(jì)算樣品中的蕓香苷、槲皮素、山萘酚含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)性試驗(yàn)

分別精確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)使用液、苦蕎供試品溶液各 20 μL，用LC-20A高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，獲得液相色譜分離圖。由圖1可以看出，蕓香苷、槲皮素及山奈酚與其相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)、各色譜峰面積均超過10 000，溶劑對(duì)譜峰幾乎無干擾。

2.2 波長的選擇

通過UV-2450日本島津紫外可見分光光度計(jì)，在190～380 nm范圍內(nèi)分別對(duì)混合對(duì)照品溶液中的蕓香苷、槲皮素和山奈酚色譜峰進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果顯示，上述3種成分均在280、365 nm附近有最大吸收，因此本研究選擇280、365 nm 2個(gè)波長，對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。由于365 nm紫外光獲得的HPLC譜峰較好，因此最后選擇吸收波長為365 nm的紫外光對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。

2.3 流動(dòng)相選擇

在試驗(yàn)過程中，采用甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、甲醇-0.1%乙酸作為流動(dòng)相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸作為流動(dòng)相的色譜峰存在拖尾現(xiàn)象，沒有達(dá)到理想的分離效果。而以甲醇-0.1%乙酸溶液作為流動(dòng)相以后，可明顯改善HPLC色譜峰峰形，分離效果較好。因此，本研究最終選擇甲醇-0.1%乙酸溶液為流動(dòng)相。

2.4 線性關(guān)系分析

分別精確量取適量混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用甲醇進(jìn)行稀釋，使各成分的濃度達(dá)到如下水平：蕓香苷，0.5、1、5、25、50、100、200 μg/mL；槲皮素，0.3、1.5、3、15、30、60、120 μg/mL；山萘酚，0.2、1、2、10、20、40、80 μg/mL。將各溶液注入液相色譜儀，按照設(shè)定色譜條件進(jìn)行HPLC測(cè)定。平行進(jìn)樣測(cè)定3次，以峰面積平均值y與進(jìn)樣量x(μg)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程(表2)。

表2 蕓香苷、槲皮素、山奈酚線性回歸方程

結(jié)果表明，所得線性方程的相關(guān)系數(shù)均在0.99以上，表明曲線具有很好的線性關(guān)系。以2倍基線噪聲所對(duì)應(yīng)的濃度計(jì)算出本方法中蕓香苷、槲皮素、山奈酚的檢出限分別為 0.011、0.004、0.004 μg，表明本方法的線性范圍較寬。

2.5 精密度試驗(yàn)

精確吸取“1.2.3”節(jié)中的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液20 μL，按設(shè)定的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得蕓香苷、槲皮素、山奈酚峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.29%、0.27%、0.28%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品芽苗粉，按照“1.2.2”節(jié)中的方法，平行制備4份供試樣品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，蕓香苷、槲皮素、山奈酚平均含量分別為25.27、0.31、0.021 mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.22%、1.63%、2.37%(n=6)，表明本法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取芽苗粉，按照“1.2.3”節(jié)中的方法，配制供試樣品溶液，分別于制備后0、12、24、48 h進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，蕓香苷、槲皮素、山奈酚峰面積RSD分別為1.06%、1.31%、1.42%(n=6)，表明48 h內(nèi)，供試樣品溶液可保持穩(wěn)定性。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

在同一組容量瓶中，分別加入等量的芽苗粉樣品，然后再分別加入不同量的蕓香苷、槲皮素、山奈酚標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，測(cè)定其回收率。結(jié)果表明，苦蕎粉中蕓香苷回收率為 97.77%～99.17%，槲皮素回收率為93.97%～97.99%，山奈酚回收率為96.76%～98.59%，RSD分別為0.71%、2.09%、0.94%(表3)，符合定量分析中準(zhǔn)確度的要求，回收效果較好。

2.9 3種苦蕎粉中黃酮類物質(zhì)含量測(cè)定

采用HPLC法，對(duì)芽苗粉、蕎麥葉粉、籽粒粉中的蕓香苷、槲皮素、山奈酚進(jìn)行測(cè)定，利用外標(biāo)法計(jì)算其含量。表4結(jié)果表明，蕓香苷在各種苦蕎粉中的含量高于槲皮素、山奈酚；蕓香苷、槲皮素在芽苗粉中的含量均高于蕎麥葉粉、籽粒粉，而山奈酚在籽粒粉中的含量最高，其次是芽苗粉，在蕎麥葉粉中山奈酚含量最低。

表4 不同來源苦蕎粉中黃酮類物質(zhì)含量(n=4)

3 討論與結(jié)論

采用HPLC法，對(duì)用苦蕎籽粒、芽苗菜、蕎麥葉制作成的苦蕎粉中的蕓香苷、槲皮素、山奈酚進(jìn)行精確定量分析，結(jié)果表明，蕓香苷、槲皮素含量在芽苗粉中的含量最高，在籽粒粉中含量最低。有研究發(fā)現(xiàn)，苦蕎籽粒在萌發(fā)過程中，一些活性成分如蕓香苷、槲皮素、D-手性肌醇等的含量會(huì)顯著上升，特別是蕓香苷，含量可上升十幾倍[6-8]。一般蕎麥種子在萌發(fā)過程中，苯丙氨酸解氨酶(PLA)活性上升，而黃酮類物質(zhì)的含量隨著PLA活性增強(qiáng)而上升[9]，因此，苦蕎籽粒萌發(fā)成芽苗菜后，芽苗菜中的蕓香苷、槲皮素含量顯著上升。趙玉平等測(cè)定和分析了苦蕎麥不同器官中的黃酮含量差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)苦蕎葉片中的蕓香苷、槲皮素含量顯著高于籽粒[10-11]。因此可見，本試驗(yàn)結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致。

本研究表明，苦蕎籽粒粉中的山奈酚含量最高，然后是芽苗粉，蕎麥葉粉中的含量最低。這與夏清等的研究結(jié)果[12-13]類似，具體的原因有待進(jìn)一步分析。

綜上所述，本研究建立的HPLC檢測(cè)體系，可應(yīng)用于苦蕎粉中蕓香苷、槲皮素、山奈酚的精確定量分析，方法簡便快速，結(jié)果準(zhǔn)確，且節(jié)省了時(shí)間，可用于苦蕎粉的質(zhì)量控制。

參考文獻(xiàn)：

[1]曹吉祥，韓怡峰. 涼山苦蕎產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀與發(fā)展對(duì)策[J]. 中國農(nóng)技推廣，2014，30(10)：9-11.

[2]馬關(guān)次，唐 艷，陳 丹，等. 威寧縣苦蕎產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及發(fā)展思路的研究[J]. 內(nèi)蒙古科技與經(jīng)濟(jì)，2015(24)：14-15.

[3]李 飛，任 清，季 超，等. 苦蕎籽粒黃酮的提取純化及抗氧化活性研究[J]. 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)，2015，33(6)：57-64，82.

[4]彭德川，徐家鈺，陳 思，等. 不同量黑苦蕎茶對(duì)小鼠血糖及糖耐量的影響[J]. 食品研究與開發(fā)，2008，29(9)：4-6.

[5]濮生財(cái)，魯 璐，焦 威，等. 不同品種苦蕎中的4種活性黃酮含量[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2015，21(3)：470-476.

[6]侯建霞. 苦蕎麥中活性成分及其在萌發(fā)過程中變化的研究[D]. 無錫：江南大學(xué)，2007.

[7]祖 悅，張曉軍，蔣 丹，等. 蕎麥芽苗菜培養(yǎng)過程中蘆丁含量變化研究[J]. 牡丹江師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2015(4)：48-50.

[8]石 磊，劉 超，梁 霞，等. 萌發(fā)蕎麥中蘆丁和槲皮素含量變化的研究[J]. 食品研究與開發(fā)，2016，37(15)：30-33.

[9]唐 宇，趙 鋼. 蕎麥中苯丙氨酸解氨酶活力與黃酮含量的關(guān)系[J]. 西南科技大學(xué)學(xué)報(bào)(哲學(xué)社會(huì)科學(xué)版)，1998(1)：9-12.

[10]趙玉平，肖春玲. 苦蕎麥不同器官總黃酮含量測(cè)定及分析[J]. 食品科學(xué)，2004，25(10)：264-266.

[11]邵美紅，林 兵，孫加焱，等. 不同品種苦蕎麥不同器官總黃酮含量的比較分析[J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2011，20(1)：86-87.

[12]夏 清，黃艷菲，李 波，等. HPLC法測(cè)定蕎麥不同種不同部位槲皮素和山柰酚的含量[J]. 中藥材，2014，37(7)：1149-1151.

[13]張冬梅. 苦蕎芽菜培養(yǎng)及其次生代謝產(chǎn)物黃酮的代謝調(diào)控[D]. 西安：陜西科技大學(xué)，2012.