閆 敏， 李 磊， 張 強(qiáng)， 馮悅晨， 孫 捷， 武文麗

(1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與資源研究所，山西太原 030031； 2.山西省土壤環(huán)境與養(yǎng)分資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原 030031)

風(fēng)化煤是煤層的露頭部分長(zhǎng)期氧化、風(fēng)化、水解形成的一種低級(jí)別煤[1]，其共生的礦物質(zhì)較多，富集著較多的微量元素，且含有大量再生腐殖酸(HA)和多種含氧活性官能團(tuán)[2]，是腐殖酸的重要來(lái)源之一。腐殖酸不僅用于工業(yè)、醫(yī)藥和環(huán)保等領(lǐng)域[3-4]，而且廣泛用于農(nóng)業(yè)[5-7]。隨著腐殖酸應(yīng)用的深入研究，風(fēng)化煤中的腐殖酸具有廣闊的開發(fā)利用前景。我國(guó)風(fēng)化煤貯藏量豐富，集中分布于山西、新疆、內(nèi)蒙古、黑龍江、云南等地區(qū)[8]，但其理化性質(zhì)卻存在明顯差異，這直接影響風(fēng)化煤的降解效果。隨著微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)處理煤炭成為了國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，大量的研究表明，利用微生物可顯著提高風(fēng)化煤的降解效果，但受到風(fēng)化煤樣品、微生物菌株及其發(fā)酵工藝等的影響，同一微生物菌株因不同風(fēng)化煤樣而存在明顯的轉(zhuǎn)化差異， 不同微生物菌株對(duì)同一風(fēng)化煤樣也存在明顯的

轉(zhuǎn)化差異，即微生物菌株對(duì)不同的風(fēng)化煤樣存在不同的降解特性，同時(shí)發(fā)酵工藝的優(yōu)化可以提高降解率，這就使得微生物菌種與風(fēng)化煤之間匹配及降解特性的研究顯得十分重要。本研究以3個(gè)不同來(lái)源的風(fēng)化煤樣為研究材料，其總腐殖酸、游離腐殖酸和黃腐酸的含量存在明顯差異，篩選出具有降解作用的微生物菌株F36，并在液體培養(yǎng)條件下，從各腐殖酸含量及結(jié)構(gòu)的變化上分析菌株對(duì)其的降解特性，為優(yōu)化其發(fā)酵工藝、提高風(fēng)化煤的降解效率及進(jìn)一步應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株F36以風(fēng)化煤為唯一碳源，分離自菜園土壤，保存于筆者所在實(shí)驗(yàn)室。供試3種風(fēng)化煤的理化性質(zhì)見(jiàn)表1。

表1 3種風(fēng)化煤的理化性質(zhì)

以上檢測(cè)由中國(guó)腐殖酸工業(yè)協(xié)會(huì)腐殖酸質(zhì)量檢測(cè)中心(太原)完成。

供試培養(yǎng)基有固體定性培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基2種，其中固體定性培養(yǎng)基[9]：Na2HPO44.0 g，KH2PO41.0 g，NaCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 0.05 g，酵母浸出粉6.0 g，去離子水1 000 mL，瓊脂15～20 g；液體培養(yǎng)基[9]：(NH4)2SO42.6 g，K2HPO41.0 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 0.01 g，去離子水1 000 mL，風(fēng)化煤10.0 g，pH值6.0。

1.2 風(fēng)化煤在固體平板上的定性降解測(cè)定

將純化的菌種F36接種到固體定性培養(yǎng)基上，28 ℃下培養(yǎng)；待菌絲基本長(zhǎng)滿平板表面后，將滅菌的3個(gè)風(fēng)化煤樣均勻?yàn)⒃诰ι希^續(xù)培養(yǎng)，每天觀察并記錄風(fēng)化煤顆粒的變化情況。

1.3 風(fēng)化煤降解菌株的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：將菌株F36采用PDA平板、顯微鏡(乳酸石炭酸棉蘭染色)對(duì)菌落、菌絲、孢子等結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，并參照文獻(xiàn)[10-11]進(jìn)行鑒定。

分子生物學(xué)鑒定：將純化的菌株F36活化培養(yǎng)后，委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將18S rDNA測(cè)序結(jié)果提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)并進(jìn)行BLAST比對(duì)。

1.4 風(fēng)化煤液體降解特性的研究

將菌株F36活化后，接種到液體培養(yǎng)基中，每50 mL培養(yǎng)基接種量為1/4個(gè)平板，28 ℃下培養(yǎng)7 d后離心(12 000 r/min)15 min，上清液稀釋12.5倍后測(cè)定190～280 nm(間距5 nm)的吸光度；測(cè)定上清液中黃腐酸、水溶性腐殖酸的含量[11]。同時(shí)，將上清液先用6 mol/L H2SO4調(diào)節(jié)pH值至1，形成絮狀沉淀，然后離心(12 000 r/min)15 min，沉降物在75 ℃下烘干，即得固體水溶性組分并進(jìn)行FT-IR分析[9-10]。液體培養(yǎng)沉降物在75 ℃下烘至恒質(zhì)量，計(jì)算損失的質(zhì)量，失質(zhì)量率為培養(yǎng)基中加入的風(fēng)化煤質(zhì)量與沉降物質(zhì)量(包括菌體和未分解的風(fēng)化煤)之間的差值與原加入風(fēng)化煤的質(zhì)量之比，用百分?jǐn)?shù)表示，同時(shí)做不接種的空白對(duì)照(CK)，重復(fù)3次。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Minitab 14軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Tukey’s進(jìn)行多重比較。文中圖采用Excel繪制，圖中數(shù)據(jù)表示為3個(gè)重復(fù)的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株F36對(duì)3個(gè)風(fēng)化煤樣在固體定性培養(yǎng)基上的降解作用

菌株F36在固體定型培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，待菌絲基本長(zhǎng)滿平板后加入3個(gè)風(fēng)化煤樣繼續(xù)培養(yǎng)3 d，培養(yǎng)基被染成了棕黃色，說(shuō)明菌株對(duì)3個(gè)風(fēng)化煤樣均出現(xiàn)了不同程度的溶媒現(xiàn)象(圖1)。

2.2 菌種鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 菌株F36菌落在PDA的呈現(xiàn)橙色的色素，分生孢子梗頂端不形成膨大的頂囊，經(jīng)過(guò)多次分支，產(chǎn)生幾輪對(duì)稱或不對(duì)稱的小梗，形如掃帚，稱為帚狀體，分生孢子為球形、橢圓形或短柱形(圖2、圖3)，初步判定為青霉屬。

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定 將測(cè)得的18S rDNA基因序列(圖4)在NCBI上進(jìn)行同源性檢索，結(jié)果表明，所測(cè)序列與青霉屬(Penicilliumsp.)同源性為99%。綜合形態(tài)特征和18S rDNA基因序列同源性兩方面分析，該菌株鑒定為青霉屬(Penicilliumsp.)。

2.3 風(fēng)化煤液體降解特性的研究

2.3.1 液體培養(yǎng)下降解物紫外分析 從圖5可以看出，在液體培養(yǎng)條件下，菌株F36對(duì)3個(gè)風(fēng)化煤樣培養(yǎng)的上清液的吸光度曲線即菌株對(duì)3個(gè)風(fēng)化煤樣的降解特性是相似的。接種微生物處理的吸光度曲線與不接種的處理相似， 但吸光度顯著增強(qiáng)，并且波長(zhǎng)越短，增加的幅度越高，其中菌株F36對(duì)YF06號(hào)風(fēng)化煤的降解作用較強(qiáng)。這說(shuō)明培養(yǎng)過(guò)程中風(fēng)化煤中有大量的物質(zhì)，極有可能是腐殖酸類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為水溶性狀態(tài)，所溶解出來(lái)的物質(zhì)組成也受到接種的影響，吸收低波長(zhǎng)紫外光的物質(zhì)顯著增加。

2.3.2 液體培養(yǎng)下降解物紅外分析 液體培養(yǎng)后風(fēng)化煤YF01降解物的紅外光譜分析結(jié)果(圖6)表明，接種菌種F36與對(duì)照相比，譜圖的形狀基本相似，在1 620 cm-1處的峰形減弱，1 540 cm-1處的有一小峰，1 400 cm-1(脂族C—H變形振動(dòng))處的峰形明顯減弱且呈現(xiàn)4個(gè)肩峰，1 240 cm-1峰形有明顯的減弱，1 120、910、600～760 cm-1處發(fā)生了不同程度的位移，而在 850 cm-1處有加強(qiáng)峰。說(shuō)明可能是碳鏈縮短、羧基官能團(tuán)和芳香共軛雙鍵含量存在差異，結(jié)構(gòu)較復(fù)雜且另含有其他官能團(tuán)，降解作用較強(qiáng)，對(duì)于失質(zhì)量的效果應(yīng)較為突出。

圖8顯示了液體培養(yǎng)后，風(fēng)化煤YF09降解物的紅外光譜分析結(jié)果。接種菌株F36與對(duì)照相比，譜圖的形狀變得復(fù)雜且有明顯的加強(qiáng)作用。1 400、1 240～1 010、912、858～468 cm-1沒(méi)有明顯的特異峰，但各峰均有明顯的加強(qiáng)，特別是在1 400、1 240～1 010 cm-1處加強(qiáng)，表明其降解產(chǎn)物中有趨于棕腐酸類物質(zhì)，有利于更好地利用，并且降解作用應(yīng)在失質(zhì)量和水溶性腐殖酸類物質(zhì)的含量上具有較好的效果。

2.3.3 液體培養(yǎng)下風(fēng)化煤的降解特性 從風(fēng)化煤液體培養(yǎng)后的失質(zhì)量率(圖9)變化看出，接種F36后各風(fēng)化煤的失質(zhì)量率明顯高于對(duì)照。對(duì)照風(fēng)化煤YF01、YF06、YF09的失質(zhì)量率分別是4.7%、4.3%、10.9%；接種菌株F36后的失質(zhì)量率約為23.7%、20.5%、31.9%，且接種F36后，對(duì)風(fēng)化煤YF01的降解效果最好。

從風(fēng)化煤液體培養(yǎng)后的上清液中水溶性腐殖酸含量的變化看出，接種F36后各風(fēng)化煤培養(yǎng)液中水溶性腐殖酸的含量相較于對(duì)照均明顯提高。YF01、YF06、YF09對(duì)照風(fēng)化煤的培養(yǎng)液中水溶性腐殖酸含量分別是1.26%、0.29%、1.55%；接種菌株F36后的培養(yǎng)液中水溶性腐殖酸含量約為3.69%、1.74%、3.15%。其中，接種F36的培養(yǎng)液對(duì)風(fēng)化煤YF06的降解效果增強(qiáng)幅度最大，而風(fēng)化煤YF01的培養(yǎng)液中水溶性腐殖酸的含量最高(圖10)。

從風(fēng)化煤液體培養(yǎng)后的上清液中黃腐酸含量的變化可以看出，接種F36后各風(fēng)化煤培養(yǎng)液中黃腐酸含量相較于對(duì)照均明顯提高。YF01、YF06、YF09對(duì)照風(fēng)化煤的培養(yǎng)液中黃腐酸的含量分別是0.54%、0.31%、0.59%；接種菌株F36后的培養(yǎng)液中黃腐酸的含量約為1.30%、0.76%、1.44%。其中，接種F36的培養(yǎng)液對(duì)3個(gè)風(fēng)化煤樣的降解效果差異不大，而風(fēng)化煤YF09的培養(yǎng)液中黃腐酸的含量最高(圖11)。

3 討論與結(jié)論

我國(guó)風(fēng)化煤儲(chǔ)量巨大，約為1 000億t，且煤種豐富[8]。風(fēng)化煤作為腐殖酸的重要來(lái)源之一，其總腐殖酸含量10%～60%，且不同風(fēng)化煤樣間存在明顯的差異。筆者根據(jù)總腐殖酸、游離腐殖酸和黃腐酸的含量以及pH值的差異，選取YF01、YF06和YF09號(hào)風(fēng)化煤作為研究材料，其中風(fēng)化煤YF01和YF09的總腐殖酸和游離腐殖酸含量基本接近，但風(fēng)化煤YF01中腐殖酸類物質(zhì)含量都較高，而風(fēng)化煤YF09中腐殖酸類物質(zhì)含量都較低；風(fēng)化煤YF06的總腐殖酸含量較高，但游離腐殖酸含量較低。以期從3個(gè)差異較大風(fēng)化煤樣入手，解析它們對(duì)菌株F36降解作用的響應(yīng)，為青霉菌株F36的降解機(jī)理的進(jìn)一步研究和生產(chǎn)提供依據(jù)。

隨著利用微生物轉(zhuǎn)化煤類物質(zhì)研究的廣泛開展，越來(lái)越多的微生物菌種進(jìn)入了研究的范圍，主要包括白腐菌、曲霉、木霉、青霉、鏈霉菌、假單胞菌及芽孢桿菌等屬的微生物。本研究中的降解微生物是青霉，對(duì)3個(gè)風(fēng)化煤樣均具有不同程度的降解作用。這些微生物以煤中腐殖酸類物質(zhì)作為碳源和能源，使其發(fā)生降解，并且對(duì)煤類物質(zhì)中的縮合芳香結(jié)構(gòu)有較明顯的選擇性降解作用[12]，所以也使得降解效果存在明顯的差異，不同微生物與不同煤樣的作用有一定的匹配關(guān)系。韓威等對(duì)8種微生物對(duì)23個(gè)煤樣的研究表明，菌種對(duì)煤樣的生物溶媒效果差異較大[13]；張昕等研究了4種真菌降解山西臨汾和內(nèi)蒙古風(fēng)化煤后的失質(zhì)量率，其平均差異在10%左右[9]；馮曉霄等研究的微生物菌株對(duì)新疆低階煤的轉(zhuǎn)化率為50%左右[14]；王春穎等通過(guò)優(yōu)化工藝參數(shù)使風(fēng)化煤的降解率達(dá)到29.28%[15]。本研究中菌株F36對(duì)失質(zhì)量率的差異在10%以上，液體培養(yǎng)后腐殖酸類物質(zhì)也存在差異。紅外光譜分析表明，菌株F36對(duì)3個(gè)風(fēng)化煤樣的作用集中在羧基官能團(tuán)上，表現(xiàn)為水溶性腐殖酸含量的增加，而且在羧基振動(dòng)上變化較多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，可能存在多種腐殖酸類物質(zhì)，有利于降解產(chǎn)物的利用；而且對(duì)風(fēng)化煤YF01和YF06的作用集中在碳鏈的縮短上，表現(xiàn)為失質(zhì)量率較高；這一結(jié)果和液體培養(yǎng)后3個(gè)風(fēng)化煤樣在失質(zhì)量率和水溶性腐殖酸含量的變化結(jié)果相一致。因此，可以從菌株F36對(duì)3個(gè)風(fēng)化煤的降解特性差異的角度進(jìn)一步對(duì)其降解機(jī)理和降解效果進(jìn)行研究。

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