李 香，許義紅，孫曉惠，韓忠耀，付云燕，伍俊科

(黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，貴州都勻 558000)

野棉花為毛茛科銀蓮花屬植物打破碗花花的根(Anemone hupehensis Lem.)或全草，多年生草本植物，苗藥亦稱米花棍。主要含白頭翁素、多糖等成分，由于采集方便、療效顯著，在貴州黔南苗族聚集區(qū)被廣泛用于腳氣腫痛、風(fēng)濕骨痛、跌打損傷、癰疽腫毒、蜈蚣咬傷等癥候的治療[1-2]，通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料，野棉花有鎮(zhèn)痛作用，但其抗炎鎮(zhèn)痛作用活性部位未見有關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過對野棉花全草不同提取物的抗炎鎮(zhèn)痛作用進(jìn)行比較，為其下一步抗炎鎮(zhèn)痛有效成分及作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 SPF級昆明種小鼠700只，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，許可證號:SCXK(黔)2016-0002，由貴州醫(yī)科大學(xué)提供。小鼠分別飼養(yǎng)于空調(diào)室內(nèi)，室溫(22±2)℃，濕度(70±5)%，喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，自由飲水和攝食。

1.2藥品、試劑及儀器 乙酸乙酯、正丁醇、石油醚分析純(重慶江川化工有限公司)；二甲苯、冰醋酸、角叉菜膠均為分析純(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52AA(上海亞榮生化儀器廠)；GJ-8402型熱板測痛儀(中國浙江醫(yī)療器械廠)；電子天平(瑞士METTLER)；阿司匹林腸溶片(批號：ZKA1402)。

1.3方法

1.3.1樣品制備 野棉花采自貴州黔南苗族布依族自治州都勻市，經(jīng)黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校魏學(xué)軍教授鑒定為毛茛科銀蓮花屬植物打破碗花花(Anemone hupehensis Lem.)全草。野棉花全草用75%乙醇回流提取，減壓濃縮，回收乙醇至稠膏，得粗提物，將粗提取物用蒸餾水混懸，分別用乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶劑，冷凍干燥，得到野棉花粗提物、乙酸乙酯、正丁醇提取物和水部位，各提取物密封置冰箱中冷藏，臨用前以配成所需濃度。

1.3.2分組及給藥 小鼠分為70組，每組10只。即生理鹽水組(空白對照組)，根據(jù)全草生藥用量6～12 g及提取后得膏率折算小鼠用量后選取中劑量0.78 g/kg作為阿司匹林組(陽性對照組)濃度。將野棉花75%乙醇粗提物、乙酸乙酯、正丁醇、水部位的高、中、低劑量組，根據(jù)其得膏率及其全草生藥用量,設(shè)計(jì)其高中低劑量分別為1.56、0.78、0.39 g/kg。

1.3.3耳廓腫脹[3]各組小鼠連續(xù)灌胃給藥7 d，末次給藥30 min，于小鼠右耳正反兩面均勻涂二甲苯每只0.2 mL，左耳不涂以對照。30 min后小鼠脫頸處死，剪下左、右耳片，用6 mm打孔器沿同一位置打下左右耳片，于電子天平精密稱重，右耳質(zhì)量-左耳質(zhì)量=腫脹度，腫脹抑制率=(模型組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)×100%/模型組平均腫脹度。

1.3.4足跖腫脹[4-5]各組小鼠連續(xù)灌胃給藥7 d后于小鼠右后足墊皮下注射1.0%角叉菜膠45 μL致炎，再給予對應(yīng)藥物，于次日處死小鼠，剪下雙后足，精密稱量，足跖腫脹度=右足重量-左足重量。腫脹抑制率=(模型組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)×100%/模型組平均腫脹度。

1.3.5棉球肉芽腫脹[6-7]各組小鼠注射乙醚進(jìn)行淺麻醉，將滅菌的棉球約4.5 mg植入小鼠右腋窩下，縫合，各組小鼠連續(xù)灌胃給藥7 d，末次給藥1 h后處死，取出棉球，70 ℃烘箱干燥至恒重，精密稱重，肉芽腫脹重=干燥后棉球重-原棉球重，計(jì)算小鼠肉芽腫脹抑制率。腫脹抑制率=(模型組平均肉芽腫干重-給藥組平均肉芽腫干重)×100%/模型組平均肉芽腫干重。

1.3.6熱板致痛[8]取小鼠于實(shí)驗(yàn)前用熱板測痛儀(55.0±0.5)℃測定小鼠舔后足所需時(shí)間作為小鼠的痛閾值，挑選痛閾值在5～30 s內(nèi)的。各組小鼠連續(xù)灌胃給藥7 d，末次給藥1 h后，分別將小鼠置于熱板上測定痛閾值，痛閾提高率(%)=(給藥后平均痛閾值-給藥前平均痛閾值)/給藥前平均痛閾值×100%。

1.3.7醋酸致扭體反應(yīng)[9]各組小鼠連續(xù)灌胃給藥7 d，末次給藥1 h后，各小鼠腹腔分別注射0.6%冰乙酸20 mL/kg,觀察并記錄小鼠扭體潛伏期及15 min內(nèi)各小鼠扭體反應(yīng)的次數(shù)，計(jì)算鎮(zhèn)痛率。鎮(zhèn)痛率=(空白對照組平均扭體次數(shù)-給藥組平均扭體次數(shù))×100%/空白對照組平均扭體次數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1抗炎作用效果分析 與空白對照組比較，小鼠耳廓腫脹、足趾腫脹及棉球肉芽腫脹實(shí)驗(yàn)水部位低劑量的抗炎作用差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余各劑量提取部位均有明顯的抗炎作用(P<0.05)，見表1～3。

表1 野棉花不同提取物對小鼠耳廓腫脹的影響

*：P<0.01，與空白對照組比較

表2 野棉花不同提取物對小鼠足跖腫脹的影響

*：P<0.01，與空白對照組比較

2.2鎮(zhèn)痛作用效果分析 與空白對照組比較，其他各組均有明顯的鎮(zhèn)痛作用(P<0.05)，見表4、5。

表3 野棉花不同提取物對小鼠棉球肉芽腫的影響

*：P<0.01，與空白對照組比較

表4 野棉花不同提取物對熱板法致痛的影響

*：P<0.01，與空白對照組比較

表5 野棉花不同提取物對扭體法小鼠疼痛的影響

續(xù)表5 野棉花不同提取物對扭體法小鼠疼痛的影響

*：P<0.01，與空白對照組比較

3 討 論

疼痛是機(jī)體受到內(nèi)外環(huán)境的一種傷害性刺激時(shí)出現(xiàn)的情緒反應(yīng)的生理病理過程?？梢暈闄C(jī)體受到傷害的警告，發(fā)揮防御保護(hù)的作用，同時(shí)也是多種疾病一種癥狀。中醫(yī)方面認(rèn)為，通則不痛，痛則不通。如果經(jīng)脈流行，血?dú)猸h(huán)轉(zhuǎn)，上下內(nèi)外，若病邪相加，氣行不暢，血運(yùn)不調(diào)則氣血不通，不通則痛。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)很多組胺，鉀離子等炎性介質(zhì)既引起炎癥又致痛。目前相關(guān)文獻(xiàn)表明，很多生物堿，苷類，多糖有一定抗炎鎮(zhèn)痛的作用[10-11]。

野棉花全草盛產(chǎn)于貴州省黔南苗族聚集區(qū)，一年四季均可采集使用，課題組在開展課題之前，走訪貴州黔南許多中醫(yī)醫(yī)生，稱其在腫瘤、積食、腫痛、殺蟲方面有一定作用，特別是鎮(zhèn)痛與殺蟲效果比較顯著，在民間被廣泛用于腳氣腫痛、風(fēng)濕骨痛、跌打損傷、癰疽腫毒、馬腹痛、牙痛[12-13]等癥候的治療。由于全年可采，鎮(zhèn)痛療效顯著，因此成為貴州黔南民間常用的中藥，雖然該藥具備一定鎮(zhèn)痛作用，但其鎮(zhèn)痛作用的活性部位，鎮(zhèn)痛抗炎有效成分，鎮(zhèn)痛抗炎機(jī)制未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，因此本課題第一次通過實(shí)驗(yàn)來探索野棉花在抗炎鎮(zhèn)痛方面的療效，為下一步其鎮(zhèn)痛抗炎的有效成分及鎮(zhèn)痛抗炎機(jī)制提供研究基礎(chǔ)，并為鎮(zhèn)痛抗炎新藥研究奠定一定理論基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)以抗炎、鎮(zhèn)痛為主要指標(biāo)。根據(jù)相關(guān)參考文獻(xiàn)制備野棉花全草的粗提物、乙酸乙酯、正丁醇、水層等不同提取物。根據(jù)其用藥6～12g及其得膏率，設(shè)計(jì)高、中、低3個(gè)不同劑量組。與空白對照組比較，小鼠耳廓腫脹、足趾腫脹及棉球肉芽腫脹實(shí)驗(yàn)水部位低劑量的抗炎作用差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余各劑量提取部位均有顯著的抗炎鎮(zhèn)痛作用(P<0.05)。乙酸乙酯部位在熱板法鎮(zhèn)痛試驗(yàn)中活性最強(qiáng)，正丁醇部位在小鼠耳廓腫脹、足趾腫脹及棉球肉芽腫脹抗炎實(shí)驗(yàn)中和扭體法中活性最強(qiáng)。初步判斷正丁醇和乙酸乙酯部位是其主要的

抗炎鎮(zhèn)痛活性部位。實(shí)驗(yàn)表明，野棉花具備良好的抗炎鎮(zhèn)痛作用，同時(shí)，隨著增加不同提取物的劑量，其鎮(zhèn)痛率、痛閾值、抑制率越高，腫脹度與扭體次數(shù)降低，證明高劑量組有較好的鎮(zhèn)痛抗炎效果，下一步將對其具體作用機(jī)制和有效成分進(jìn)行深入研究。

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