徐 洋， 藺凌云， 尹文林， 姚嘉赟， 潘曉藝， 袁雪梅， 沈錦玉

(農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/浙江省魚類健康與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江湖州 313001)

黃顙魚(PelteobagrusfulvidracoRichardson)別稱昂刺、黃姑子、黃臘丁等，隸屬于鲇形目(Siluriformes)鲿科(Bagridae)黃顙魚屬(PelteobagrusBleeker)[1]，因其肉質(zhì)細(xì)嫩、營(yíng)養(yǎng)豐富、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等特點(diǎn)，成為我國(guó)重要的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類[2-3]。隨著黃顙魚養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大、養(yǎng)殖密度的提高、養(yǎng)殖環(huán)境的惡化及養(yǎng)殖管理的相對(duì)滯后，黃顙魚疾病的暴發(fā)日益頻繁，已成為制約黃顙魚養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的主要因素。要實(shí)現(xiàn)對(duì)病害的有效防治，必須借助漁用疫苗等免疫技術(shù)進(jìn)行預(yù)防[4]。近30年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)黃顙魚的分類、生物學(xué)特性、人工繁殖和養(yǎng)殖方式等做了大量研究工作[5-6]，但有關(guān)黃顙魚免疫學(xué)的研究還處于起步階段?，F(xiàn)有文獻(xiàn)探討了幾種純化蛋白的技術(shù)在黃顙魚血清免疫球蛋白(IgM)純化中運(yùn)用的可行性[7]，研究了IgM抗原刺激后的表達(dá)規(guī)律及在轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平的個(gè)體發(fā)育[8]，檢測(cè)了黃顙魚IgM重鏈基因在各組織中的表達(dá)情況以及經(jīng)免疫刺激后的變化規(guī)律[9]，但尚未見(jiàn)黃顙魚免疫球蛋白單克隆抗體研制和應(yīng)用的報(bào)道。因此，我們開(kāi)展了黃顙魚血清IgM單克隆抗體的研究，試圖將單克隆抗體運(yùn)用于黃顙魚體液免疫應(yīng)答規(guī)律、病原診斷和疫苗開(kāi)發(fā)應(yīng)用等的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

健康黃顙魚，購(gòu)自浙江省湖州市東林鎮(zhèn)保豐黃顙魚養(yǎng)殖場(chǎng)，體質(zhì)量(500±10) g；6～8周齡雌性BALB/c小鼠，購(gòu)自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；小鼠的骨髓瘤細(xì)胞SP2/0由揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑

RPMI-1640和胎牛血清，購(gòu)自博士德生物工程有限公司；DMSO、HT、HAT和PEG4000，購(gòu)自Sigma公司；TMB顯色液和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG，購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit，購(gòu)自Roche公司；Protein A HP柱，購(gòu)自GE公司；其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 黃顙魚免疫球蛋白的提取

取健康黃顙魚尾靜脈采血，室溫靜置1 h，4 ℃過(guò)夜，次日4 000 r/min離心15 min，取上清液。血清加等體積生理鹽水稀釋后，緩慢加入pH值為7.0的飽和硫酸銨至30%飽和度，4 ℃靜置過(guò)夜，10 000 r/min離心30 min，取上清繼續(xù)加入飽和硫酸銨至最終飽和度為50%，同上處理，收集沉淀溶解于0.02 mol/L PBS(pH值7.4)，再經(jīng)PBS 4 ℃透析脫鹽，獲得黃顙魚免疫球蛋白粗提液，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ↑S顙魚免疫球蛋白粗提液1.0 mL，與HiTrap Protein A HP柱4 ℃結(jié)合3～4 h；用0.02 mol/L pH值為7.4 PBS以1.0～1.5 mL/min流速洗脫未結(jié)合蛋白至D280 nm<0.01；用0.1 mol/L pH值為3.0檸檬酸以1.0～1.5 mL/min流速洗脫結(jié)合蛋白，以200 μL/管收集洗脫峰，合并洗脫峰，用0.02 mol/L pH值為7.4 PBS 4 ℃ 透析過(guò)夜，-20 ℃保存?zhèn)溆?；同時(shí)進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.4 BALB/c小鼠的免疫

取50 μg純化的黃顙魚血清免疫球蛋白與等體積弗氏完全佐劑充分乳化，背部皮下多點(diǎn)及腹腔注射BALB/c小鼠，首免后14、28 d各用等量抗原與弗氏不完全佐劑混合進(jìn)行免疫，融合前3 d腹腔加強(qiáng)免疫1次。

1.5 細(xì)胞融合

細(xì)胞融合按常規(guī)方法[10]，取免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞混合于融合管內(nèi)，PEG-4000處理使細(xì)胞融合，將融合細(xì)胞加入裝有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.6 陽(yáng)性雜交瘤的篩選與腹水制備

待融合細(xì)胞生長(zhǎng)到培養(yǎng)孔面積的1/10時(shí)，取培養(yǎng)上清用間接ELISA法進(jìn)行篩選，用純化的黃顙魚血清免疫球蛋白作為包被抗原，2 μg/mL，100 μL/孔，4 ℃過(guò)夜包被；10%小牛血清于37 ℃封閉3 h，用PBST洗滌3次，5 min/次；加入雜交瘤上清37 ℃孵育1 h，以SP2/0上清作為陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照為免疫血清；同上洗滌3次，加入1 ∶1 000辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG 37 ℃孵育1 h，100 μL/孔；同上洗滌3次孔加入TMB顯色液，100 μL/孔，于暗處反應(yīng)30 min，加入2 mol/L硫酸溶液終止反應(yīng)，50 μL/孔，讀取D450 nm值。經(jīng)復(fù)測(cè)仍為強(qiáng)陽(yáng)性的克隆用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，克隆化至陽(yáng)性率達(dá)100%，即可定株并凍存；雜交瘤細(xì)胞株經(jīng)凍存、復(fù)蘇后取5×106對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞腹腔接種BALB/c小鼠，10～14 d 后采集腹水，離心收集上清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 單抗特性鑒定

1.7.1 亞級(jí)份測(cè)定 按Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit說(shuō)明書進(jìn)行。

1.7.2 腹水ELISA效價(jià)的測(cè)定 以2 μg/mL純化的黃顙魚免疫球蛋白包被酶標(biāo)板，4 ℃過(guò)夜，封閉后加腹水抗體，腹水稀釋度為1 ∶103～1 ∶(2.187×106)，100 μL/孔，其余步驟同“1.6”節(jié)。

1.7.3 western-blot分析 黃顙魚免疫球蛋白經(jīng)SDS-PAGE后，采用Bio-red微型電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)進(jìn)行電轉(zhuǎn)移，恒壓 15 V，轉(zhuǎn)移45 min。轉(zhuǎn)印完畢后NC膜用脫脂奶粉封閉1 h，PBST洗滌后與1 ∶1 000的腹水結(jié)合1 h，洗滌后與1 ∶1 000的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠 IgG結(jié)合1 h，洗滌后DAB顯色，拍照記錄。

1.7.4 單抗靈敏度測(cè)定 純化黃顙魚免疫球蛋白起始濃度為2 μg/mL倍比稀釋至10 ng/mL，100 μL/孔，4 ℃包被過(guò)夜，封閉后加入1 ∶1 000腹水抗體，100 μL/孔，其余步驟同“1.6”節(jié)。

1.7.5 單抗特異性測(cè)定 收集黃顙魚、鲇魚、鰻鱺、鯽魚、草魚、鳊魚、鱸魚、鱖魚和白魚等淡水魚血清作為待檢抗原，各種血清1 ∶1 000稀釋后包被酶標(biāo)板，一抗加1 ∶1 000腹水抗體，其余步驟同“1.6”節(jié)。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫原的制備與檢驗(yàn)

按“1.3”節(jié)中所述的過(guò)程制備抗原，用核酸蛋白儀測(cè)定提純的抗原濃度為1 mg/mL。由圖1可知，SDS-PAGE凝膠電泳圖譜上可以看到2條清晰的蛋白帶，分別代表黃顙魚Ig的重鏈和輕鏈。計(jì)算和分析結(jié)果表明，黃顙魚血清IgM重鏈和輕鏈的分子量分別為73、30 ku。

2.2 細(xì)胞融合與篩選

經(jīng)過(guò)篩選最終獲得能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞2株，分別命名為B10-C3和F6-F2。

2.3 單抗效價(jià)與特性分析

由表1可知，2株單抗均為IgG2a亞類；腹水抗體效價(jià)為1 ∶(7.29×105)。由圖1可知，2株單抗能與轉(zhuǎn)印后的黃顙魚血清IgM發(fā)生反應(yīng)，都是識(shí)別的重鏈區(qū)；單抗F6-F2對(duì)純化的黃顙魚免疫球蛋白的檢測(cè)靈敏度為20 ng，單抗B10-C3對(duì)純化的黃顙魚免疫球蛋白的檢測(cè)靈敏度為39 ng。

表1 單抗特性分析

2.4 單抗特異性測(cè)定

由表2可知，F(xiàn)6-F2和B10-C3僅與黃顙魚血清發(fā)生反應(yīng)，與被試的其他血清均無(wú)任何交叉反應(yīng)。

表2 單克隆抗體的特異性

注：“++”表示強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)；“+”表示陽(yáng)性反應(yīng)；“-”表示陰性反應(yīng)。

3 討論

要實(shí)現(xiàn)對(duì)黃顙魚病害的有效防治，推動(dòng)黃顙魚養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展，必須借助免疫技術(shù)進(jìn)行疾病預(yù)防，而免疫防治的效果受諸多因素影響，要達(dá)到理想的免疫防治效果，需考慮黃顙魚自身免疫系統(tǒng)組成特點(diǎn)及免疫應(yīng)答規(guī)律[11]。IgM是魚類體液免疫應(yīng)答的重要組成部分，利用單克隆抗體研究魚類IgM是最常用的方法之一[12]。近20年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)魚類免疫球蛋白的單抗開(kāi)展大量研究工作，制備了部分淡水魚[13-16]及海水魚類[17-21]血清IgM的單克隆抗體。本研究通過(guò)Protein A親和層析純化黃顙魚血清免疫球蛋白，進(jìn)而制備了2株抗黃顙魚免疫球蛋白單克隆抗體B10-C3和F6-F2。根據(jù)SDS-PAGE的結(jié)果推測(cè)黃顙魚免疫球蛋白的重鏈和輕鏈分別為73、30 ku，與黃艷青等利用MBP親和層析純化黃顙魚血清IgM的分子量結(jié)果[22]相一致。

從單抗特異性試驗(yàn)的結(jié)果可看出，這2株單抗高度特異，本研究共選取包括黃顙魚在內(nèi)的9種不同魚血清進(jìn)行測(cè)試，2株單抗僅與黃顙魚發(fā)生特異性反應(yīng)，與其他8種魚血清都無(wú)交叉反應(yīng)，其中包括和黃顙魚同為鲇形目的鲇魚。這一現(xiàn)象說(shuō)明了鲇形目不同屬之間的血清Ig相似度較低。從單抗的靈敏度測(cè)定結(jié)果可知，單抗F6-F2對(duì)純化的黃顙魚IgM檢測(cè)靈敏度為20 ng，與歐洲鰻、南方鲇和鱖[23-25]等免疫球蛋白單抗的靈敏度進(jìn)行比較，單抗F6-F2的靈敏度極高，今后可成為黃顙魚病原診斷和血清學(xué)調(diào)查的重要工具。

Western-Blot分析結(jié)果表明，2株單抗呈陽(yáng)性反應(yīng)，都識(shí)別于黃顙魚IgM的重鏈區(qū)，沒(méi)有獲得抗輕鏈的單抗。目前已報(bào)道的魚IgM的單抗大部分可以識(shí)別魚的IgM重鏈，僅少量可以抗輕鏈[26]，這與魚血清IgM分子的結(jié)構(gòu)有關(guān)，由于其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列多且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，可提供多個(gè)抗原表位；而輕鏈上免疫表位少。

綜上所述，黃顙魚IgM單克隆抗體的制備有助于深入分析黃顙魚免疫球蛋白結(jié)構(gòu)與功能，該單抗可廣泛應(yīng)用于黃顙魚免疫應(yīng)答水平監(jiān)測(cè)和疫苗免疫效果的評(píng)價(jià)，為黃顙魚免疫學(xué)深層次研究奠定基礎(chǔ)。

：

[1]王升明. 黃顙魚的生物學(xué)特性與繁殖技術(shù)[J]. 農(nóng)技服務(wù)，2010，27(3)：373，418.

[2]萬(wàn)松良，黃永濤，劉 敏，等. 瓦氏黃顙魚的含肉率及營(yíng)養(yǎng)成分分析[J]. 水利漁業(yè)，2008，28(3)：59-61.

[3]祁保霞，白鳳珍，馬國(guó)杰. 黃顙魚生物學(xué)特性及池塘養(yǎng)殖技術(shù)[J]. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2009，24(1)：72-74.

[4]劉秀梵 .單克隆抗體在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用[M]. 合肥：安徽科學(xué)技術(shù)出版社，1994：56-89.

[5]王令玲，仇潛如，鄒世平，等. 黃顙魚生物學(xué)特點(diǎn)及其繁殖和飼養(yǎng)[J]. 淡水漁業(yè)，1989(6)：23-24，31.

[6]王衛(wèi)民. 黃顙魚的規(guī)模入工繁殖試驗(yàn)[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，1999，18(3)：9-12.

[7]黃艷青. 黃顙魚基礎(chǔ)免疫的研究[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003：15-22.

[8]李春濤. 黃顙魚IgM分子及其表達(dá)研究[D]. 重慶：西南大學(xué)，2012：45-50.

[9]葉仕根，費(fèi)陽(yáng)春，李 強(qiáng)，等. 黃顙魚免疫球蛋白M基因的克隆與組織表達(dá)分析[J]. 大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，28(6)：515-521.

[10]陶義訓(xùn). 免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，1997.

[11]楊廷彬，尹學(xué)念. 實(shí)用免疫學(xué)[M]. 長(zhǎng)春：長(zhǎng)春出版社，1994：401-407.

[12]Cartwright G A，Chen D，Hanna P J，et al. Immunodiagnosis of virulent-strains of aeromonas-hydrophila associated with epizootic ulcerative syndrome(eus) using a monoclonal-antibody[J]. Journal of Fish Diseases，1994，17(2)：123-133.

[13]Lobb C J，Clem L W. Fish lymphocytes differ in the expression of surface immunoglobulin[J]. Developmental and Comparative Immunology，1982，6(3)：473-479.

[14]Secombes C J，van Groningen J J，Egberts E. Separation of lymphocyte subpopulations in carpCyprinuscarpioL. by monoclonal antibodies：immunohistochemical studies[J]. Immunology，1983，48(1)：165-175.

[15]Sánchez C P，Lopez-fierro L，Zapata A，et al. Characterization of monoclonal antibodies against heavy and light chains of trout immunoglobulins[J]. Fish & Shellfish Immunology，1993，3(4)：237-251.

[16]Al-Harbi A H. Truax R，thune R L.production and characterization of monoclonal antibodies against tilapia oreochromis niloticusimmunoglobulin[J]. Aquaculture，2000，188：219-227.

[17]Magnadótttir B. Kristjánsdóttir H，Gudmundsdótttir S. Characterisation of monoclonal antibodies to separate epitopes on salmon IgM heavy chain[J]. Fish & Shellfish Immunology，1996，6(3)：185-198.

[18]Bang J D，Kim J W，Lee S D，et al. Humoralimmune response of flounder toEdwardsiellatarda：the presence of various sizes of immunoglobulins in flounder[J]. Diseases of Aquatic Organisms，1996，26(3)：197-203.

[19]Romestand B，Breuil G，Bourmaud C F，et al. Development and characterization of monoclonal antibodies against sea bass immunoglobulinsDicentrarchuslabraxLinaeus，1758[J]. Fish & Shellfish Immunology，1995，5(5)：347-357.

[20]Scapigliati G，Romano N，Picchietti S，et al. Monoclonal antibodies against sea bassDicentrarchuslabrax(L.) immunoglobulins：immunolocalization of immunoglobulin-bearing cells and applicability in immunoassays[J]. Fish & Shellfish Immunology，1996，6(5)：383-401.

[21]dos Santos N M S，Taverne N，Taverne-Thiele A J，et al. Characterisation of monoclonal antibodies specific for sea bass(DicentrarchuslabraxL.)IgM indicates the existence of B cell subpopulations[J]. Fish & Shellfish Immunology，1997，7(3)：175-191.

[22]黃艷青，王桂堂，孫 軍，等. 黃顙魚血清免疫球蛋白的純化及分子量的初步測(cè)定[J]. 水生生物學(xué)報(bào)，2003，27(6)：654-656.

[23]林天龍，陳 強(qiáng)，龔 暉，等. 歐洲鰻免疫球蛋白單克隆抗體的制備與特性[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2001，25(6)：532-537.

[24]張小萍，魏 靜，邱 艷. 南方鲇免疫球蛋白單克隆抗體的制備及特性[J]. 水生生物學(xué)報(bào)，2012，36(3)：379-384.

[25]王 凡，林天龍，潘厚軍，等. 鱖免疫球蛋白單克隆抗體的制備及特性[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2006，30(2)：285-288.

[26]van der Heijden M H，Rooijakkers J B，Booms G H，et al. Production，characterisation and applicability of monoclonal antibodies to European eel (AnguillaanguillaL.，1758) immunoglobulin[J]. Veterinary Immunology and Immunopathology，1995，45(1/2)：151-164.