謝麗萍，鐘俊杰，張旭哲，李冠孚

東北大學 中荷生物醫(yī)學與信息工程學院，遼寧 沈陽 110819

引言

基因檢測已成為疾病早期診斷、有害細菌或病毒檢測、以及法醫(yī)學應用的關鍵技術[1-2]。目前，已經(jīng)開發(fā)出多種用于篩選基因突變的方法，包括等位基因雜交法、核苷酸摻入的引物延伸法、質(zhì)譜法、核酸測序以及實時定量聚合酶鏈反應檢測等。但是，大多數(shù)的方法需要高成本的探針標記以及昂貴的檢測儀器（如激光共焦生物芯片掃描儀，CCD生物芯片掃描儀）[3-4]。此外，熒光探針容易漂白，增加了操作的復雜性。

露珠的形成是自然界中一種典型的水汽凝結現(xiàn)象。平時不容易看出的蜘蛛網(wǎng)，掛上露珠后晶瑩剔透，在陽光下異常顯眼。凝結的露水通過反射光線，使得蜘蛛網(wǎng)相比背景更亮，產(chǎn)生了更強的可視信號。水汽凝結產(chǎn)生的圖案提供了一種穩(wěn)定的、無標記以及無需供能的“綠色”成像方法，常用于玻璃清潔度及均一性檢查[5]。隨著人們對水汽凝結的興趣的增長，很多的研究集中于形成水汽凝結的實驗方法研究及理論探討。水汽凝結方法已用于制作各種多孔材料[6]，甚至設計可調(diào)控的汽凝納米顯微鏡[7]。很多研究采用水汽凝結方法識別不同應用目的的自組裝分子層排布[8-9]。水汽凝結是一種低成本、無損傷、無需供能的“綠色”方法，可以在短時間內(nèi)（1 min）區(qū)分表面屬性，并且具有高度可重復性[10]。

為了降低檢測成本，Xie等[11]首次報道了利用水汽凝結信號檢測p53基因的249編碼區(qū)的基因突變。分析物引起的DNA擴增網(wǎng)絡改變了檢測點的濕度，水汽凝結信號讀取方式將芯片的濕度變化轉化為可視信號，只需哈一口氣，即可實現(xiàn)基因突變的肉眼識別。哈氣形成水汽凝結的方法雖然操作簡便，但受外界環(huán)境的影響較大，在一些惡劣條件下，如高溫（＞40℃），空氣濕度低（＜30%）等條件下，哈氣不易形成凝結，影響信息的讀取。

本項目搭建了便攜式汽凝儀，提供了基于汽凝法的基因芯片檢測信號輸出環(huán)境，將超聲霧化的原理結合到汽凝儀中，提供了穩(wěn)定的濕度條件，并可實時采集圖像，對采集的圖像進行分析，自動定位芯片捕獲探針的陣列點，實現(xiàn)了基因點突變信號的讀取。

1 系統(tǒng)硬件

1.1 結構設計

汽凝儀由控制分析模塊、顯示模塊、圖像采集模塊、超聲霧化模塊組成，見圖1。本文采用Solidworks軟件設計了便攜式汽凝儀的外觀以及內(nèi)部結構（圖1a）。完成三維結構設計后，使用光敏樹脂為原材料，利用3D打印機打印出儀器的整體結構。汽凝儀的外觀，見圖1b。特別強調(diào)的是，為防止超聲霧化模塊對其他模塊的影響，采用了分隔設計，圖像采集模塊在超聲霧化模塊的正上方，與汽凝儀其他模塊分開，通過隔板隔離（圖1c），確保了超聲霧化模塊不會將水霧噴灑到微型控制器上而導致系統(tǒng)發(fā)生故障。超聲霧化模塊的上面設置載物臺（圖2a），放置待測芯片。超聲霧化模塊的儲水箱的設計利用了蓄水的原理。從載物臺的右側注水口注入純凈水，左端插入霧化片（圖2b），并采用密封膠密封，形成水霧的供給源。設置5個噴口，采用彎形噴嘴設計，以增大噴霧面積及分散噴霧強度。霧化片接觸水面產(chǎn)生水霧，通過出霧口噴出，增加了芯片表面空氣的濕度，為基于汽凝法的基因芯片的檢測提供了水汽凝結的檢測環(huán)境。

圖1 汽凝儀結構示意圖

圖2 汽凝儀的超聲霧化模塊的結構示意圖

1.2 硬件功能

汽凝儀的硬件部分由pcDuino微型控制器、超聲霧化模塊、圖像采集模塊和顯示模塊等構成（如圖1c）。pcDuino3是搭載AllWinner 雙核A20芯片的微型電腦[12-13]，有最高達1 GB的RAM，機身自帶有4 GB內(nèi)存，可通過microSD存儲卡擴充至32 GB，能根據(jù)項目的需求自行選擇搭載Ubuntu、Android等多種操作系統(tǒng)。該系統(tǒng)完全滿足了汽凝儀對硬件的功能需求。Ubuntu系統(tǒng)能較為容易的適配攝像模塊和顯示模塊的相關驅動，方便后續(xù)的工作。更為重要的是，相比于樹莓派等其他微信電腦，pcDuino自身搭載了Arduino開發(fā)環(huán)境，完全兼容Arduino的開發(fā)接口，便于功能模塊的擴展，如加濕模塊就可以使用Arduino串口方式供電或者操控，而不僅僅是依賴于pcDuino本身自帶的USB接口供電。pcDuino構成了汽凝儀的核心控制模塊。

汽凝儀的超聲霧化模塊的功能是提供一個穩(wěn)定的水汽環(huán)境。本文應用家用加濕器工作方式，通過超聲產(chǎn)生水霧環(huán)境。本文設計的超聲波電路利用超聲霧化片產(chǎn)生霧化的水汽，通過特定的通道將霧化的水汽集中引向生物芯片上方，增加了空氣濕度，使水汽可以凝結在芯片表面，以便觀察實驗結果。超聲霧化模塊由陶瓷霧化片及其驅動電路以及儲水箱構成。霧化片放置在儲水箱中，采用密封膠密封好后，注入水，霧化片接觸到水，便可以產(chǎn)生水霧。霧化片的驅動電路實現(xiàn)出霧量的控制。其驅動電路包括穩(wěn)壓部分、升壓部分以及單片機部分。通過升壓電路和5 V的穩(wěn)壓電路維持單片機以及霧化片正常工作電壓，然后通過預設程序讓單片機輸出一定頻率的方波，通過陶瓷霧化片的高頻振蕩使水霧化，出霧量穩(wěn)定，操作方便。

圖像采集模塊采用500萬像素的微距攝像頭，可以較為清晰的采集到芯片上的照片。因為鏡頭與芯片距離固定，焦距不會變化，采用手動對焦方便快捷，故在裝置安裝好以后需要調(diào)好焦距再進行照片的采集。顯示模塊采用IPS（平面轉換）電阻觸摸屏顯示采集的芯片圖像。

2 DNA芯片圖像處理算法

為了實現(xiàn)基因芯片的陣列點的自動識別分析，本文開發(fā)了基因芯片圖像處理算法。首先通過圖像預處理方式進行除噪，然后將圖像中的反應點都分割出來，對分割后的圖像進行判斷。如果沒有不需要的噪點，便可以將檢測點的位置信息保存下來，將這些位置信息和預先給定的芯片反應點位置信息進行比對，識別哪些位點發(fā)生了特異性反應從而得出該芯片的實際反應結果。具體操作如下：第一步是將采集到的原始圖像轉化為8位的灰度圖，用圓盤結構體對灰度圖像進行一次腐蝕操作，接著對其進行形態(tài)學開重建，再對其進行一次膨脹操作，最后進行形態(tài)學閉重建。經(jīng)過上述步驟，可得到大部分小的噪點被消除的灰度圖像。盡可能消去噪點后，需要將反應點從預處理后的灰度圖中提取出來。擴展極小變換是一種相對精確的求區(qū)域極小的算法，相比于直接求區(qū)域極小變換，擴展極小變換可以抑制那些與周圍區(qū)域相比對比度較?。ㄐ∮陂撝担┑臉O小點，本文記錄下區(qū)域邊界的灰度值，然后給整個區(qū)域加上一個閾值，對于加閾值后灰度值大于等于原邊界灰度值的，將其置成原邊界灰度，以有效改善區(qū)域極小變換過分割的情況。相比一般的分水嶺算法，擴展極小變換能更好地將圖像中的亮點區(qū)分開，不留下過多的噪點。在得到黑白二值化的圖像后，本文會先根據(jù)留下的白點大小進行一次去噪，將明顯的噪點去除。同時，因為芯片上的陣列點是呈垂直對應的關系，根據(jù)這個特征，可以先對一定數(shù)量的圖像進行統(tǒng)計，判定出反應點之間的距離D。由于芯片距離攝像頭的位置是不會改變的，故圖像中反應點之間距離D是一個定值。在經(jīng)過基于面積中值的去噪后，可通過對比每個點圓心為中心的x、y軸方向上距離為D的是否存在其他反應點作為判斷的依據(jù)。若其在x、y軸4個垂直方向的一定距離內(nèi)不存在其他對應關系的點，那么就判定這個點是噪點，再進行一次去噪。經(jīng)過兩次去噪，能基本全部除去原圖像上的噪點，只留下芯片上反應的檢測點。標記識別出的基因點突變反應點，從而完成基因點突變自動識別分析，此算法能精確的區(qū)分反應點，算法識別準確度高。

3 驗證實驗

由博奧生物芯片有限公司制備突變捕獲探針（5 μm）陣列，各個檢測點之間距離200 μm。將100 nM的待檢測的基因突變片段（表1中野生序列、突變序列）、5 μm報告探針和0.8 U/μL Taq DNA連接酶組成的混合液 5 μL，加入到芯片表面，60℃下反應1 h。之后浸泡在0.01 M NaOH溶液中5 min。去除反應液，向芯片表面加入10 μM環(huán)模板、10 μM鏈條與0.2 μL的T4 DNA 連接酶混合液，室溫反應2 h。取5 U/μL Phi29 DNA聚合酶、緩沖液以及880 μM dNTP）5 μL加入到芯片表面，30℃反應4 h。采用本文汽凝儀觀察記錄檢測結果。

4 結果與討論

為了驗證本文汽凝儀的功能，進行了人體抑癌基因p53的220編碼區(qū)的基因突變檢測實驗。p53是目前世界上研究較為廣泛的抑癌基因。它是生物體中一種抑制正常細胞轉變?yōu)榘┘毎幕颍诳刂萍毎L，增殖及凋亡方面充當著重要作用。p53抑癌基因突變可能會引發(fā)腫瘤產(chǎn)生。檢測抑癌基因p53的基因點突變的序列設計，見表1。設計原則遵循：捕獲探針與報告探針無互補雜交，即捕獲探針存在時，不能與報告探針形成非特異性連接，保證只有目標基因存在時才能產(chǎn)生信號的輸出。檢測原理，見圖3。

首先是芯片的制備，通過點樣儀將捕獲探針通過5’端的氨基與環(huán)氧硅烷修飾的SiO2修飾的硅片連接，每個基因點間距為200 μm，每個基因點直徑約為50 μm。待分析物與報告探針一起加入到芯片上，當待分析物與捕獲探針、報告探針能無差錯的堿基互補配對，則將報告探針與捕獲探針連接起來。若當待分析物與捕獲探針、報告探針有一個堿基的錯配，報告探針無法連接捕獲探針。之后，向芯片上加入環(huán)（借助鏈條DNA使環(huán)形模板連接成環(huán)狀）。利用滾環(huán)擴增技術擴增出大量的DNA[14-15]。由于DNA網(wǎng)絡具有親水性，特異性識別的區(qū)域的濕潤度發(fā)生改變，無目標檢測基因的檢測點，由于無法連接報告探針，不能進行RCA擴增，檢測點濕潤度不發(fā)生改變。汽凝儀的超聲霧化片產(chǎn)生的水霧遇到芯片表面，在特異性識別區(qū)域（即濕潤度改變區(qū)域）形成一層水膜[16]，通過光的反射現(xiàn)象，可以將DNA的一個堿基的基因突變事件轉變?yōu)榭梢暪饩€，形成可視的光斑。光斑與DNA的堿基突變事件正相關，即若待檢測物中含有目標的DNA序列，芯片檢測點處擴增出大量DNA，改變了此檢測位點的親水性，水汽凝結在表面形成的水膜對該位點起到了放大作用，通過微距鏡頭采集由顯示模塊顯示采集結果。

表1 單鏈核苷酸序列

本文采用基因芯片用以檢測抑癌基因p53的220編碼區(qū)的基因突變（TAT ＞ -TGT）。固定了野生基因TAT、突變基因TGT的捕獲探針的芯片，通過基因特異性識別來檢測相應的野生基因TAT、突變基因TGT。最后通過汽凝儀進行信號采集和輸出。水汽凝結后的芯片檢測結果輸出，見圖4a，前兩行為特異性識別野生基因TAT的結果，后兩行為特異性識別突變基因TGT的結果。通過基因芯片圖像處理算法，可實現(xiàn)自動識別特異性檢測區(qū)域，并準確的圈出特異性信號輸出區(qū)域（圖4b）。為了進一步突出顯示特異性識別區(qū)域，以黑白二值化突出顯示檢測結果（圖4c）。與芯片基底固定相應探針的位置對比，可以確切得出目標基因的出現(xiàn)，即使有一個基因點突變，該方法也可以特異性識別出來。汽凝儀為基于汽凝法檢測基因突變提供了濕度環(huán)境，并可以采集圖片，實現(xiàn)圖片基因突變檢測點的自動識別。相比于基于熒光的芯片檢測儀器，大大降低了成本[17-18]。

圖 4 基于汽凝法的基因芯片檢測的照片（標尺為400 μm）

5 結論

本文開發(fā)了一種新型的基于水汽凝結原理的汽凝儀，成本低于500元，結合RCA擴增的基因點突變識別技術，可實現(xiàn)基因點突變的汽凝法檢測。該系統(tǒng)集成了控制模塊、顯示模塊、超聲霧化模塊、數(shù)據(jù)采集模塊，并通過3D打印技術，構建了汽凝儀的外觀結構。此外，開發(fā)了用于自動識別基因點突變的檢測算法。本文采用此設備檢測了p53的220編碼區(qū)的TAT到TGT突變識別驗證實驗表明了本文汽凝儀的數(shù)據(jù)采集和顯示功能并成功用于芯片基因點突變檢測。

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