于新芬 寇宇 周銀燕 李鈞 錢昕 楊旭輝 潘勁草

310021 杭州市疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)科

急性呼吸道感染(acute respiratory tract infection, ARI)是兒童常見的感染性疾病，嚴(yán)重威脅兒童健康，給社會和家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。2010年全球住院兒童中有1 190萬為重癥患者，300萬為重癥下呼吸道感染患者[1]。呼吸道病毒及肺炎衣原體、肺炎支原體是引起嬰幼兒ARI的重要病原體。常見的呼吸道病毒包括：呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒(PIV)1-4型、流感病毒A和B(Flu)、人鼻病毒(HRV)等。近年來新的病毒病原體也不斷被報(bào)道，包括冠狀病毒(NL63和HKU1)，人偏肺病毒(hMPV)、人博卡病毒(HboV)和Saffold心肌炎病毒(SAFV)。肺炎支原體(MP)、肺炎衣原體(CP)也是引起幼兒ARI的重要病原體，過去由于對其認(rèn)識不足和檢測手段的限制，其感染狀況被低估。隨著新發(fā)現(xiàn)病原體數(shù)量的增多及臨床實(shí)驗(yàn)室多重檢測病原體能力的提高，?？稍谝粋€(gè)樣本中檢測到多個(gè)病原體，突出了合并感染在急性呼吸道感染中的潛在重要角色。呼吸道病原體合并感染的真正意義目前還是有爭議的[2-4]。本研究對門診和住院嬰幼兒急性呼吸道感染病例中的病原譜進(jìn)行了檢測分析，旨在了解杭州地區(qū)病毒及肺炎支原體、衣原體的流行特征、合并感染特征，評估多重感染的臨床意義，指導(dǎo)臨床治療、避免抗生素不合理使用，進(jìn)而更好地做好疾病控制。

1 材料與方法

1.1樣本來源收集2011年至2013年杭州地區(qū)0～10歲患兒急性呼吸道感染病例樣本共908份,標(biāo)本采集獲患者知情同意。每周于杭州某兒童醫(yī)院采集ARI住院病例樣本共計(jì)652份，均為呼吸道吸出物。每周于該醫(yī)院兒科門診采集ARI病例樣本共計(jì)256份，均為咽拭子；所有樣本采集后送本中心實(shí)驗(yàn)室，于-80 ℃冰箱存放。

1.2核酸提取使用QIAgen DNA mini kit(51304)提取病原體DNA，使用 QIAgen RNeasy mini kit(74104)提取病毒RNA。實(shí)驗(yàn)操作步驟嚴(yán)格按說明進(jìn)行。最后將核酸溶解于50 μl ddH2O中。

1.3逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)PCR檢測使用PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，6210 A)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系為：1 μl 50 ng/ μl的6-per 隨機(jī)引物，1 μl dNTP(10 mmol/L each)，8 μl提取的RNA，混勻置65 ℃ 5 min，冰上迅速冷卻。再加入反應(yīng)液：4 μl 5×PrimeScript II Buffer，0.5 μl Rnase Inhibitor(40 U/ μl), 1 μl PrimeScript II Rtase(200 U/μl)，ddH2O 4.5 μl。30 ℃ 10 min，42 ℃ 60 min進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，70 ℃ 15 min滅活酶，置冰上冷卻。cDNA保存于-30 ℃冰箱。

1.4常見呼吸道病毒及肺炎支原體和衣原體的篩檢熒光定量PCR儀為ABI 7300。MP，CP的的檢測使用上海之江試劑盒，檢測按試劑盒說明書進(jìn)行。病毒檢測使用合成引物探針及Ex Taq酶(Takara，DRR001A)進(jìn)行，引物探針序列參考文獻(xiàn)[5-8]，由上海超世生物科技有限公司合成。

RNA病毒的檢測：樣本進(jìn)行了RSV、HRV、FluA, FluB、SAFV、PIV1-4、HKU1，OC43，229E，NL63，hMPV的檢測。取1 μl cDNA為模板，擴(kuò)增使用EX Taq酶，反應(yīng)體積為20 μl，含1×buffer、MgCl23 mmol/L、dNTPs各0.2 mmol/L、引物各0.4 μmol/L、探針各0.2 μmol/L、Ex Taq酶25 U/ml。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min；95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，45個(gè)循環(huán)。于60 ℃檢測通道的熒光信號。

DNA病毒檢測：樣本進(jìn)行了腺病毒(AdV)和博卡病毒(hBoV)的檢測。取樣本DNA2 μl為模板，擴(kuò)增使用使用EX Taq酶，反應(yīng)體系和條件同上。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 17.0軟件分析檢測結(jié)果和臨床數(shù)據(jù)。采用χ2檢驗(yàn)比較不同組的差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1人口學(xué)特征本研究共收集908份呼吸道感染病例樣本，患者年齡分布從1個(gè)月至10歲。門診病例與住院病例的比例是1∶2.55。256例門診病例中，<1歲72例，1～<3歲94例，3～<6歲53例，6～≤10歲37例；男孩與女孩的比例是1.98∶1。652例住院病例中，<1歲475例，1～<3歲126例，3～<6歲27例，6～≤10歲24例；男女比例1.88∶ 1。

表1 兒童急性呼吸道感染不同年齡組病原的檢出情況及兩組病例病原檢出率的比較

注：表內(nèi)的χ2值和P值為門診病例和住院病例兩組病例病原檢出率的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

Note:χ2andPvalue in this table are the statistical analysis results between outpatients and inpatients

2.2病原體熒光PCR檢出情況住院急性呼吸道感染病例樣本中，呼吸道病毒及MP、CP的總檢出率是76.7%(500/652)，而在門診病例樣本中，總的檢出率是43.0%(110/256)，兩者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=94.79，P<0.001)。在門診病例中，最常見的感染是AdV，陽性率為15.2%(39/256)，其次是Flu(11.7%)、PIV(7.8%)、hMPV(6.6%)。門診和住院患兒各病原的檢出情況詳見表1。門診病例中，檢出的PIV以PIV-3型最多，占檢出PIV的60%(12/20)。其次是PIV-1型，占35%(7/20)，僅檢到1株P(guān)IV-4型，未檢測到PIV-2型。在住院病例中，檢出最多的也是PIV-3型，占91.4%(74/81)，其次是PIV-2(4.9%)型和PIV-1型(3.7%)，未檢測到PIV-4型。本研究檢出的冠狀病毒95%為229E冠狀病毒，其次為OC43冠狀病毒，未檢測到其他型別的冠狀病毒。

本研究中，門診病例中AdV的檢出率高于Flu，但二者之間的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.357，P=0.198)。AdV和Flu在門診病例中檢出率較高，與住院病例的檢出率的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Flu,χ2=16.95，P<0.001；AdV,χ2=27.19，P<0.001)。RSV、HRV、SAFV、MP和CP均是在住院病例中感染率較高，與門診病例組的檢出率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，χ2值分別為97.57、20.44、14.43、33.79、13.22。PIV和hBoV在住院病例組的檢出率也是顯著高于門診病例組(P<0.05)，χ2值分別為3.95和9.49。而hMPV和CoV在兩種病例檢出率之間的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

門診和住院患兒不同年齡組病原的檢出情況詳見表1。住院病例中，隨著兒童年齡增大，RSV的陽性率逐漸降低，<1 歲嬰兒為40.4%，1～<3、3～<6、6～≤10歲組兒童則分別為21.4%、14.8%和8.3%；HRV在低年齡組(<1歲和～<3歲)陽性率較高(14.1%和19.8%)，而MP在高年齡組(3～<6歲和6～≤10歲)中陽性率較高(48.1%和37.5%)。門診病例中，隨著兒童年齡增大，流感病毒陽性率增高，4個(gè)年齡組陽性率分別為2.8%、6.4%、18.9%和32.4%。值得一提的是，兩組病例≥2種病原的感染率均是在3～<6歲年齡組最高，分別為13.2%和40.7%。

2.3季節(jié)分布特征相對于門診病例，住院病例病原的月分布更為多樣，每月的病原組成更為豐富。RSV在住院病例中具有明顯的季節(jié)特征，春季和冬季為高發(fā)季節(jié)；但RSV在門診病例中的季節(jié)分布并不明顯。PIV則在兩種病例樣本中均較常見，流行季節(jié)相似，住院病例和門診病例中分別為4～9月份和6～8月份，均在夏季有一個(gè)流行高峰。AdV在門診病例中的季節(jié)分布很明顯，4～6月份為高發(fā)期，而在住院病例中的季節(jié)分布不明顯。另有冠狀病毒、鼻病毒、偏肺病毒、SAFV等病毒在住院病例和門診病例中的季節(jié)分布均不明顯，或許需要更大量樣本來研究其季節(jié)分布特征。

2.4合并感染病原學(xué)特征本研究610例檢測陽性的病例中，206例(22.7%)患兒標(biāo)本中檢測到2種或2種以上病原。其中門診病例17例為合并感染，合并感染率為6.6%(17/256)；住院病例189例為合并感染，合并感染率為29.0%(189/652)，住院病例的合并感染率高于門診病例，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=52.34，P<0.001)。門診病例的合并感染中，二重感染16例，三重感染1例，未見四重及以上感染。二重感染中最常見的是hMPV+Flu(4/16)，其他二重感染均為1例或2例。住院病例的合并感染中，二重感染132例，三重感染43例， 四重感染12例，五重感染2例。二重感染中最常見的是RSV+hMPV(15/132)、RSV+SAFV(15/132)、RSV+HRV(14/132)和M+C(11/132)。三重感染中最常見的是RSV+M+C(5/43)、PIV+M+C(3/43)。二重和三重感染病原組合很多，其他組合例數(shù)較少，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的規(guī)律性。而四重和五重感染的病原組合均不相同。

住院病例中，除RSV和Flu合并感染率分別為36.4%和50.0%，其他病毒合并感染的病例數(shù)均大于其單一感染病例數(shù)。門診病例中，除冠狀病毒和肺炎衣原體陽性病例數(shù)少，表現(xiàn)為單一感染例數(shù)大于等于合并感染例數(shù)外，其他病毒合并感染例數(shù)均小于其單一感染例數(shù)。各病毒在門診病例中的感染以單一感染為主，在住院病例中以合并感染為主。其中AdV在兩組病例中的感染差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=18.90，p<0.001)。詳見表2。

2.5急性呼吸道感染住院病例臨床及感染特征分析本研究652例嬰幼兒急性呼吸道感染住院病例中，收集到647例病例的臨床資料。住院病例最常見的癥狀是發(fā)熱(56.9%)、咳嗽(98.0%)、氣短或呼吸困難(36.6%)、X射線顯示肺部異常(81.9%)、肺部聽診異常(87.0%)等。肺部聽診異常主要表現(xiàn)為濕羅音、痰鳴音、哮鳴音。最常見的并發(fā)癥是肺炎(88.6%)和呼吸衰竭(4.2%)。最常見的基礎(chǔ)疾病是先天性心臟病(10.8%)和哮喘(3.4%)。

本研究對病毒及MP、CP單一感染和多重感染病例的的臨床特征進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，沒有發(fā)現(xiàn)其臨床癥狀的顯著性差異，也沒有發(fā)現(xiàn)多重感染與并發(fā)癥及基礎(chǔ)疾病有顯著相關(guān)性。將病毒及MP、CP感染病例與未檢出病例進(jìn)行了臨床特征的比較，發(fā)現(xiàn)病毒或MP、CP感染病例X射線肺部異常較未檢出病例高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.92，P<0.05)。病毒或MP、CP感染病例發(fā)生肺炎的比例較未檢出病例高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.76，P<0.001)。詳見表3。

3 討論

ARI迄今仍是中國首位感染性疾病，也是抗生素使用頻率最高、數(shù)量最大、合理性亟待提高的疾病[9]。明確病原是合理用藥的基礎(chǔ)。中國幅員遼闊，各地ARI的病原體構(gòu)成有所不同，建立不同地域、不同人群ARI病原譜及感染特征，對推動(dòng)臨床ARI合理、安全及有效用藥有著積極意義。本研究表明，杭州地區(qū)ARI病例中，病毒依然是最常見的病原，這與國內(nèi)外的報(bào)道基本一致[10-12]。本研究將病毒及MP、CP感染住院病例與未檢出住院病例進(jìn)行了臨床特征的比較，發(fā)現(xiàn)病毒、MP、CP感染病例X射線肺部異常較未檢出病例高，發(fā)生肺炎的比例也較未檢出病例高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說明病毒及MP、CP是引起急性呼吸道感染住院病例X射線肺部異常和肺炎的主要病原，病毒及MP、CP未檢出病例感染的可能是細(xì)菌或其它未檢測的病毒，進(jìn)一步突出了病毒及MP、CP在急性下呼吸道感染中的重要地位。

表2 門診病例和住院病例中各病原的合并感染率比較

備注：a.合并感染率為合并感染例數(shù)/總感染例數(shù)，b.為Fisher精確檢驗(yàn)

Note: a: co-infection rate in this table means the total infection cases divided by co-infection cases.b: Fisher exact test

表3 急性呼吸道感染住院病例臨床及感染特征分析

杭州地區(qū)引起ARI住院病例的最重要病原體是RSV，其次為MP、HRV、PIV等。而門診病例中，最常發(fā)的病毒為AdV、Flu和PIV。這與劉春艷等[11]報(bào)道的北京住院和門診病例的感染情況基本一致。本研究中，除hMPV和CoV外，其他病原(RSV、PIV、HRV、Flu、hBoV、AdV、SAFV及MP、CP)在兩組病例間檢出率的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明不同病例種類之間的病原譜差異是很大的，且住院病例的病原譜更為復(fù)雜多樣，這可為ARI的防治及用藥提供一定的指導(dǎo)。本研究門診病例中AdV的檢出率(15.2%)略高于Flu(11.7%)，這可能與流感當(dāng)年流行情況有關(guān)，但仍然說明在門診病例中AdV有著較高的感染率。本研究中AdV在門診病例中的感染濃度較高，而在住院病例中通常濃度較低，多為伴隨感染，且AdV在兩組病例中的合并感染率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，更突出了AdV在門診病例中的重要地位。另外許晶等[13]對流感樣病例中腺病毒的檢出率和馮錄召等[14]、季偉等[15]對住院病例RSV和MP的檢出率，與本研究略有不同，這可能是因?yàn)椴≡餍械牡赜虿町?、樣本種類以及檢測方法不同。如本研究使用PCR方法檢測MP，而季偉等采用了PCR和ELISA聯(lián)合的方法進(jìn)行檢測。

近年來，科研人員不斷發(fā)現(xiàn)更多與呼吸道感染相關(guān)的病毒，如SAFV。SAFV是近年來從人體分離到的一種新的心病毒，至今已發(fā)現(xiàn)11種基因型[16]。SAFV除了經(jīng)糞一口途徑感染，還能通過呼吸道傳播，但相關(guān)報(bào)告甚少，且其流行病學(xué)和臨床意義尚不明了。因此，本研究對杭州地區(qū)急性呼吸道感染標(biāo)本進(jìn)行了SAFV病毒檢測，SAFV在住院病例中的陽性率為9.8%，與周瓊?cè)A等[17]報(bào)道的長沙地區(qū)的10.4%相近。本研究中SAFV在門診病例中的陽性率為2.34%，與住院病例相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。表明SAFV主要存在于住院病例的急性下呼吸道感染中。推測SAFV病毒感染可能與患兒下呼吸道感染的病程相關(guān)。

呼吸道病毒感染力強(qiáng)，傳播速度快，易造成局部流行。Ramaekers等[18]研究表明兒童較成人更容易獲得合并感染。Achten等[19]研究發(fā)現(xiàn)，病毒的合并感染存在干擾現(xiàn)象，如RSV感染兒童中，HRV的感染率明顯偏低。呼吸道常見病毒間的合并感染率一般為0.6%～27%，冬季時(shí)可高達(dá)35%。Wishaupt等[20]報(bào)道兒童ARI的合并感染率為22.5%。本研究中，住院病例合并感染率為29.0%，門診病例合并感染率為6.6%。劉春艷等[11]報(bào)道住院患兒合并感染率(30.1%)高于門診患兒(6.8%)，與本研究一致。合并感染在住院病例樣本中存在非常普遍，合并感染率可能主要與病例類型和樣本類型有關(guān)。本研究189例住院病例合并感染中，各病原體之間的合并感染組合很多，錯(cuò)綜復(fù)雜，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的規(guī)律性。本研究兒童ARI中病毒單一與合并感染的臨床癥狀之間沒有顯著性差異，與Wishaupt等[20]報(bào)道基本一致。

目前對合并感染和疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性的了解還是有限的。檢測到的病毒不一定就是主要致病原，還可能代表無癥狀存在、潛伏期等情況。一些研究表明多病原合并感染可以增加疾病的嚴(yán)重程度[2-3,21]，而另一些研究卻得出相反的結(jié)論[4]。這或許與采樣人群、臨床情況、病毒的流行季節(jié)性甚至與細(xì)菌的合并感染等有關(guān)。本研究沒有發(fā)現(xiàn)多重感染與并發(fā)癥及基礎(chǔ)疾病有顯著相關(guān)性，但住院病例中的合并感染率明顯較高，與門診病例的合并感染率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示合并感染和疾病的嚴(yán)重程度有一定關(guān)系。

利益沖突:無

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