劉蒙蒙 李利利 林琳 王笑峰 段招軍

266021 山東，青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系(劉蒙蒙、王笑峰);100052 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所腹瀉室(李利利、段招軍);250014 濟(jì)南，山東省疾病預(yù)防控制中心 山東大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)研究院 山東省傳染病預(yù)防控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(林琳)

諾如病毒(noroviruses，NVs)又稱諾瓦克病毒，屬于杯狀病毒科諾如病毒屬，是全世界引發(fā)非細(xì)菌性胃腸炎暴發(fā)和散發(fā)的重要病原[1-2]。諾如病毒屬成員分為5個(gè)基因群，其中感染人的主要為GⅠ、GⅡ和GIV，感染牛的為GⅢ，感染馬和豬的主要為GⅡ，而GV主要感染小鼠[3- 4]。2003年Karst從實(shí)驗(yàn)室小鼠中首次發(fā)現(xiàn)并分離了鼠諾如病毒-1(murine Norovirus-1,MNV-1)[5]。除了實(shí)驗(yàn)室小鼠，通過血清學(xué)或分子檢測(cè)也在野生嚙齒動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了MNV[6-7]。

鼠諾如病毒(MNV)為單股正連RNA病毒，具有杯狀病毒的典型特征，基因組全長(zhǎng)7.3 kb左右，RNA的3’末端為poly(A)結(jié)構(gòu)，5’末端無帽結(jié)構(gòu)，而與一個(gè)小分子量的蛋白(VPg)共價(jià)相連[6]。諾如病毒基因組主要包括3個(gè)開放閱讀框(open reading frame, ORFs)：RNA依賴性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)包含在此區(qū)域；ORF2編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1，包括內(nèi)部的核心區(qū)S區(qū)和向外突出的P區(qū)，P區(qū)分為P1和P2，P2區(qū)位于衣殼蛋白的最外層較易發(fā)生突變；ORF3編碼小結(jié)構(gòu)蛋白VP2，該蛋白可增強(qiáng)衣殼蛋白的表達(dá)和病毒的穩(wěn)定性[8]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)所有MNV都有第四個(gè)ORF(ORF4)，與ORF2重疊，編碼的蛋白參與固有免疫應(yīng)答[9]因?yàn)镸NV能在細(xì)胞和動(dòng)物中復(fù)制，使得小鼠成為研究諾如病毒生物學(xué)和致病機(jī)理的模式動(dòng)物，這有助于研究人員進(jìn)一步探索人諾如病毒預(yù)防和治療感染的途徑。本研究通過對(duì)來自山東省不同區(qū)域的野生鼠MNV開展相關(guān)研究，為更全面的了解國內(nèi)MNV病毒的分子遺傳特征提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本2016年11月份在山東省濟(jì)寧市嘉祥縣、青島市黃島區(qū)、淄博市淄川區(qū)捕鼠210只，鼠種包括褐家鼠、黑線姬鼠、大倉鼠、小家鼠、黃胸鼠和鼩鼱。解剖取其腸內(nèi)容物和肝臟樣本，運(yùn)輸至中國疾病預(yù)防控制中心，置于液氮中保存。本研究實(shí)驗(yàn)方案通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查，編號(hào)為20160715023。

1.2酶與試劑

1.2.1 核酸提取: QIAamp MinElute Virus Spin Kit，購自德國Qiagen公司，核酸置于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 核酸酶消化：DNaseI 消化酶，購自美國Thermo Scientific 公司。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄: SuperScript Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen公司，RNA酶抑制劑(RRI)、dNTP購自日本TakaRa公司。

1.2.4 全基因組擴(kuò)增: RT-PCR試劑盒，LA-Taq酶，Premix Ex Taq試劑， rapid amplification of cDNA Ends (RACE)試劑盒，DH5α感受態(tài)細(xì)胞，均購自日本TakaRa公司，T4 DNA連接酶購自美國NEB公司，PGEM T-easy載體購自美國Promega公司。

1.3標(biāo)本的處理及病毒核酸提取在二級(jí)生物安全柜中取綠豆大小的老鼠肝臟和糞便標(biāo)本分別加入1 ml minimum essential medium (MEM)進(jìn)行勻漿，勻漿頻率60 Hz，時(shí)間60 s。勻漿后的混合液用4 ℃離心機(jī)6 868×g離心20 min，取上清備用。將20～30只鼠的肝組織和糞便標(biāo)本勻漿液分別混合，肝組織標(biāo)本和糞便標(biāo)本各建立10個(gè)混合樣本庫。分別從每個(gè)混合樣本庫中取200 μl勻漿液經(jīng)DNaseI處理后進(jìn)行RNA的提取，洗脫液為50 μl，提取的核酸送到華大基因進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.4病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄將提取的核酸用SuperScript Ⅲ試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，反應(yīng)體系為20 μl，條件如下: 隨機(jī)引物1 μl，dNTP(10 mmol/L) 1 μl，病毒核酸10 μl，65 ℃ 5 min 預(yù)處理；5×Buffer 4 μl，0.1 mmol/L DTT 2 μl，RRI 0.5 μl，SSⅢ 0.5 μl, DNA free H2O 1 μl，25℃10 min，42 ℃ 50 min，72℃15 min，cDNA置于-20 ℃儲(chǔ)存。

1.5病毒基因組擴(kuò)增根據(jù)高通量測(cè)序拼接獲得的MNV序列設(shè)計(jì)引物，引物設(shè)計(jì)使用軟件Primer 5.0(加拿大Premier公司)，采用SeqMan軟件拼接序列。用PCR方法填補(bǔ)已知序列之間的未知序列。5′和3’末端序列采用rapid amplification of cDNA ends(RACE)方法進(jìn)行擴(kuò)增，利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，對(duì)于RACE擴(kuò)增獲得的條帶進(jìn)行切膠回收，克隆測(cè)序獲得目的序列，經(jīng)拼接后獲得該株MNV的全基因組序列。PCR產(chǎn)物序列測(cè)定在北京天一輝遠(yuǎn)生物公司進(jìn)行。

1.6小鼠諾如病毒陽性標(biāo)本的篩查根據(jù)獲得的全基因組序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增， VP1區(qū)(F1 5’-GGGTTGGCACCGTCTCATT-3’, F2 5’-TAACCTTGAGCTTGGCCC-3’, R 5’-TAGTCGGGCAACTCATCC-3’)和RdRp區(qū)(F1 5’-AGATTGGACTGGGACGTGCTT-3’， R1 5’-GCCCATACCAACCGAACTGAT-3’，F(xiàn)2 5’-ATACTGATGCTGACTTCTCCCG-3’，R2 5’-AGAGACAACCTCGTCATCACCA-3’)，擴(kuò)增長(zhǎng)度分別為120 bp和307 bp。210份標(biāo)本進(jìn)行篩查。PCR反應(yīng)體系(25 μl)：Premix Ex Taq 12.5 μl，DNA free H2O 9.5 μl，cDNA模板1 μl，上下游引物各1 μl，(引物一輪RdRP F1/R1,VP1 F1/R；二輪RdRP F2/R2,VP2 F2/R)，反應(yīng)條件為94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，30個(gè)循環(huán)，對(duì)獲得的目的條帶進(jìn)行測(cè)序。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法利用MEGA5.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，同時(shí)利用MEGA5.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap值為1,000。

2 結(jié)果

2.1MNV基因組結(jié)構(gòu)特征本研究獲得的MNV變異株基因組全長(zhǎng)為7 382 bp(命名為SDHD46)。3′端包含75 bp非編碼區(qū)和pol(A) 結(jié)構(gòu)，5’端無帽結(jié)構(gòu)而與小分子量的蛋白(VPg)共價(jià)相連。編碼區(qū)包括四個(gè)開放閱讀框(ORFs)，ORF1長(zhǎng)5 061 bp (6～5 066 nt)，編碼1 686個(gè)氨基酸，與大多數(shù)MNVs相比少3個(gè)核苷酸；ORF2長(zhǎng)1 629 bp(5 053～6 681 nt)編碼衣殼蛋白VP1(542個(gè)氨基酸)，比已知的大部分MNVs的ORF2區(qū)(1 626 bp)多三個(gè)核苷酸序列，相應(yīng)的多編碼一個(gè)氨基酸。其中ORF1 和ORF2之間有14個(gè)核苷酸的重疊區(qū)。ORF3長(zhǎng)627 bp (6 681～7 307 nt)，編碼小結(jié)構(gòu)蛋白VP2(208個(gè)氨基酸)；ORF4 (5 066～5 707)包含在ORF2中，編碼213個(gè)氨基酸。 MNV SDHD46的基因組序列上傳至GenBank，序列號(hào)為MF973199。

2.2MNV在野生鼠中的檢出分別用VP1區(qū)的半巢式及和RdRp區(qū)的巢式引物對(duì)210份鼠腸道標(biāo)本中的MNV進(jìn)行篩查，結(jié)果顯示2份標(biāo)本為MNV陽性，陽性率為0.95%。2份標(biāo)本均來自青島市黃島區(qū)的黑線姬鼠。山東濟(jì)寧市和淄博市采集的嚙齒動(dòng)物標(biāo)本中并未檢測(cè)到該病毒，說明MNV感染可能與野鼠的地理分布有關(guān)。

2.3MNV同源性分析本次實(shí)驗(yàn)分離出的MNV與選取的30株MNV參考株的全基因組核苷酸序列相似度為76.8%～78.1%，其中衣殼蛋白區(qū)VP1核苷酸序列相似度為77.1%～88.5%，編碼的氨基酸相似度為82.0%～90.6%，RdRp區(qū)編碼的氨基酸相似度為89.8%～94.7%。但是VP1高可變區(qū)域P2(278～415aa)區(qū)氨基酸序列相似度較低，為60.9%～78.1%，表明諾如病毒易于變異的特點(diǎn)。獲得的MNV與參考株的相似度分析參見表1。

表1 MNV SDHD46與來自不同地域的30株參考株序列的相似度分析

Tab.1Identity of the nucleotide and amino acid sequences between MNV SDHD46 and 30 reference strains.

2.4SDHD46VP1區(qū)氨基酸變異分析進(jìn)行了氨基酸序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)與30株參考毒株序列比較，SDHD46VP1區(qū)多了一個(gè)氨基酸，其中 SDHD46 與匈牙利的兩株(JQ408737和JQ408738)比較，363位多一個(gè)甘氨酸 (Glycine, G)；與其他的28株MNVs VP1序列比較301位多一個(gè)脯氨酸(Proline, P)。進(jìn)一步分析SDHD46 VP1不同功能區(qū)氨基酸位點(diǎn)突變情況，發(fā)現(xiàn)S區(qū)只出現(xiàn)一個(gè)突變位點(diǎn)，P2區(qū)出現(xiàn)11個(gè)突變位點(diǎn)， P1區(qū)有4個(gè)突變位點(diǎn)。氨基酸突變位點(diǎn)見表2。

2.5MNV系統(tǒng)進(jìn)化分析為了明確MNV衣殼蛋白VP1的系統(tǒng)進(jìn)化特征，我們構(gòu)建了基于核苷酸序列的進(jìn)化樹，如圖1所示，SDHD46與來自匈牙利的毒株TF7WM(JQ408738)親緣關(guān)系最近，并與來自匈牙利的毒株TF7WM 和TF5WM(JQ408737和JQ408738)以及來自英國的毒株Apo496和Apo455(JN975483和JN975491)聚集在一起形成另一進(jìn)化分支。雖然本研究MNV毒株分離自中國，但其在進(jìn)化分枝上與來自中國北京和廣州(KM458057和 KX987840)的兩株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。基于RdRp氨基酸序列的進(jìn)化樹分析表明(見圖2)，SDHD46與來自英國的毒株Apo455親緣關(guān)系最近，并聚集在一起形成獨(dú)立進(jìn)化支。在VP1進(jìn)化分析中與本研究MNV親緣關(guān)系較近的匈牙利毒株TF7WM 和TF5WM和另一英國毒株Apo496無對(duì)應(yīng)的RdRp基因序列，無法明確其在RdRp區(qū)的進(jìn)化關(guān)系是否與VP1一致。

表2 SDHD46與30株參考株VP1區(qū)氨基酸序列的突變位點(diǎn)

Tab.2The mutation of amino acid sequences in VP1 region of SDHD46 and 30 reference strains

注：30株參考毒株GenBank號(hào); Notes. Gene Bank numbers of the 30 reference strains(JQ408738、JQ408737、JN975491、JN975483、JN975535、JN975533、EU004673、EU004670、DQ223043、DQ223041、DQ223042、GQ180108、EF650480、EF650481、EU004663、EU004672、AY228235、AB601769、AB435515、AB435514、HQ317203、KX987840、KM458057、DQ911368、EF531291、EU854589、EU482058、EU482057、FJ446720、FJ446719)

注：紅色圓圈代表本實(shí)驗(yàn)在野生鼠中的分離株
圖1鼠諾如病毒VP1區(qū)核苷酸系統(tǒng)進(jìn)化樹
Note:The red circle represents the isolates of SDHD46
Fig.1 Phylogenetic analysis based on the sequences of VP1 gene of MNV

注：紅色圓圈代表本實(shí)驗(yàn)在野生鼠中的分離株
圖2鼠諾如病毒RdRP區(qū)氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹
Note:The red circle represents the isolates of SDHD46
Fig.2 Phylogenetic analysis based on the amino acid of RdRP gene of MNVs

3 討論

自MNV首次被報(bào)道以來，國際上已經(jīng)分離獲得多株病毒。MNV是目前已知的小鼠病毒中流行率最高，感染率高，流行范圍廣的動(dòng)物病毒[10]。2005年，美國和加拿大的實(shí)驗(yàn)室用血清學(xué)方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室MNV的感染率約為22.1%，其感染率約為細(xì)小病毒(感染率為2.5%)的9倍[11]。2011年袁文等[12]報(bào)道我國廣東省實(shí)驗(yàn)小鼠攜帶有MNV，用RT-PCR的方法檢測(cè)到206份小鼠盲腸內(nèi)容物，其中MNV陽性為77份，陽性率為37.38%，而且各品系小鼠易感性無顯著差異。 MNV在日本的感染率為13.1%[13]，在韓國的感染率為15.03%[14]。

本研究分離出的SDHD46是國內(nèi)分離出的首株野生鼠諾如病毒，SDHD46與已經(jīng)報(bào)道的野生鼠和實(shí)驗(yàn)室MNVs的全基因組同源性差異明顯(>21.9% nt)，其中與野生鼠VP1區(qū)同源性差異為(>12.5% nt, >9.4% aa)，這表明野生鼠MNV比實(shí)驗(yàn)鼠MNV之間存在較高的遺傳變異率。同時(shí)結(jié)合我們分析的SDHD46 P2區(qū)的變異位點(diǎn)也說明了野生鼠具有較高的遺傳變異性。 Smith報(bào)道了MNV在黑線姬鼠中具有較高的感染率和遺傳變異率，并且說明了MNV具有久遠(yuǎn)的感染起源，其感染與種屬特異性相關(guān)，本研究在收集的6種(褐家鼠、黑線姬鼠、大倉鼠、小家鼠、黃胸鼠和鼩鼱)不同種類的小鼠中，只在黑線姬鼠中檢測(cè)出兩個(gè)陽性標(biāo)本，這與Smith等[6]報(bào)道一致。與人類諾如病毒相似，MNV的P2區(qū)極易變異且含有特異性抗原決定簇和受體結(jié)合位點(diǎn)。有報(bào)道稱，VP1區(qū)氨基酸的突變可能影響其與受體結(jié)合的特異性和親和力，導(dǎo)致MNV毒力的改變[15]。此外，有研究表明，P2亞結(jié)構(gòu)域在病毒產(chǎn)生致死作用中發(fā)揮重要作用[16]。如圖2所示，SDHD46的氨基酸變異位點(diǎn)主要集中在P2區(qū)(278～415aa)，而且突變頻率高，變異率大，可能影響MNV的相關(guān)生物學(xué)功能，由基因突變導(dǎo)致的功能變化尚需進(jìn)一步研究。

人NoVs存在多種傳播途徑，重組變異率高，而且缺乏持續(xù)的免疫力，因此NoVs感染極易形成暴發(fā)性腸胃炎，產(chǎn)生嚴(yán)重的公共安全問題。但是由于人NoVs缺少合適的小動(dòng)物模型和體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，所以MNV的發(fā)現(xiàn)為其研究提供了依據(jù)。MNV能夠在體外進(jìn)行生長(zhǎng)增值，在骨髓來源的巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞上生長(zhǎng)并產(chǎn)生細(xì)胞病變(CPE)，也可以在傳達(dá)細(xì)胞小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7上生長(zhǎng)并產(chǎn)生細(xì)胞病變[13]。MNV的可復(fù)制特點(diǎn)使其成為研究NoVs 復(fù)制機(jī)制、感染機(jī)理、免疫機(jī)制和抗感染等方面最理想的病毒模型，研究人員從MNV著手研究NoVs病毒結(jié)構(gòu)蛋白、復(fù)制機(jī)制等方面都取得了重大進(jìn)展。本研究中分離出的野生鼠MNV變異株與已知的MNVs具有一定程度的差異，豐富了國內(nèi)MNV的基因庫，通過對(duì)該株MNV的基因結(jié)構(gòu)、變異特點(diǎn)和進(jìn)化來源進(jìn)行比較分析，為了解國內(nèi)MNV病毒的分子遺傳特征，流行特點(diǎn)和進(jìn)化來源研究提供了參考依據(jù)。

利益沖突:無

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