梁譞 張蓉芳 謝志萍 高寒春 段招軍 劉東海

730050 蘭州，甘肅省婦幼保健院兒童哮喘中心(梁譞、張蓉芳、劉東海)；730000 蘭州，甘肅中醫(yī)藥大學(梁譞，劉東海)；100052 北京，中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所(謝志萍、高寒春、段招軍)

毛細支氣管炎(簡稱毛支)是嬰幼兒常見的下呼吸道感染性疾病，最常見的病因是病毒感染，呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)是最常見的病原體[1]。人類博卡病毒(human bocavirus, HBoV)作為兒童呼吸道感染的重要病原與呼吸道感染相關(guān)性得到關(guān)注[2,3]。本研究應用巢式聚合酶鏈反應(nested-polymerase chain reaction，Nested-PCR) 和反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應技術(shù)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)對毛支患兒的鼻咽抽吸物進行檢測HBoV、RSV及其他常見呼吸道病毒，了解HBoV在毛支中感染狀況，并比較單一HBoV感染與單一RSV感染患兒的臨床特征。

1 資料與方法

1.1一般資料選取甘肅省婦幼保健院兒童哮喘中心院2015年01月至2016年12月收治的396例毛支患兒，診斷均符合《諸福棠實用兒科學》毛支診斷標準[4],患兒自發(fā)病至納入研究的時間均在3 d以內(nèi)，其中男性215例,女性181例，平均年齡(8.35±1.71)月。排除標準：近1個月內(nèi)有呼吸道感染史；存在先心病、先天性喉軟骨發(fā)育不全、肺部畸形、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等疾病者；存在家族哮喘史、近期接受免疫抑制劑等治療者；中途放棄治療或臨床資料不完整者。本研究經(jīng)甘肅省婦幼保健院倫理委員會批準，所有入選患兒家長均簽署治療知情同意書。

1.2標本采集采用無菌負壓法抽取納入患兒入院24 h內(nèi)鼻咽抽吸物2～4 ml，分為2份，并于采樣管上標注患兒信息，其中1份加入病2毒保存液后冷凍保存并盡快運送至中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所，進行標本HBoV、RSV及其他6種常見呼吸道病毒的核酸檢測；另1份標本于本院行細菌培養(yǎng)及真菌培養(yǎng)，同時采集對應患兒靜脈血2 ml，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗方法對肺炎支原體和肺炎衣原體進行特異性抗體檢測。詳細記錄HBoV、RSV感染陽性患兒的相關(guān)臨床資料。

1.3病毒檢測采用Nested-PCR和RT-PCR方法檢測HBoV、RSV、腺病毒(adenovirus,ADV)、流感病毒A、B型 (influenza virus A B,Flu A B)、副流感病毒1、2、3型(parainfluenza virus I～III,PIVⅠ～Ⅲ)。核酸提取使用 QIAamp病毒核酸小量提取試劑盒(Qiagen 公司)按試劑盒說明書進行。采用巢式PCR方法擴增HBoV NS1片段，第一輪引物F0∶5′-AGGTAAAACAAATATTGCAAAGGCCATAGTC-3′，R0∶5′-TGGGAGTTCTCTCCGTCCGTATC-3′，擴增片段長度732 bp；第二輪引物F1∶5′-AGGGTTTGTCTTTAACGATTGCAGACAAC-3′,R1∶5′-TATACACAGAGTCGTCAGCACTATGA-3′,擴增片段長度518 bp。反應條件為：95 ℃，5 min預變性，98 ℃ 10 s,52 ℃ 10 s，72 ℃ 1 min，擴增40個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。所有第二輪擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳純化回收后，陽性產(chǎn)物送北京天一輝遠公司測序。其他6種常見呼吸道病毒檢測所需引物序列見參考文獻[5]。

2 結(jié)果

2.1呼吸道病毒檢出率396例標本中病毒檢測陽性者212例，陽性檢出率53.54%，其中HBoV 39例(9.84%)、RSV 97例(24.49%)、PIV 34例(8.59%)、ADV21例(5.30%)、Flu 31例(7.83%)。排除常見細菌、真菌、MP、CP感染，單一HBoV感染29例，混合其他病毒感染10例 (25.64%)，混合感染的病毒為RSV 5例、PIV 3 例、ADV 2 例；單一RSV感染86例, 混合其他病毒感染11例 (11.34%)，混合感染的病毒為 HBoV 5例、 PIV 4例、ADV 1例、Flu 1例；HBoV比 RSV更易混合其他呼吸道病毒感染 (χ2=4.357，P=0.037)，以混合RSV感染多見。

2.2流行病學特點39例HBoV感染患兒中男性27例，檢出率12.56%(27/215)，女性12例，檢出率6.63%(12/ 181)，男性高于女性，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=3.890,P=0.049)。97例RSV感染患兒中男性56例，檢出率26.05%(56/215)，女性41例，檢出率22.65%(41/181)，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.612,P=0 . 0868)。

39例 HBoV 感染患兒平均月齡(8.06±2. 47)月，6 ～12月齡陽性檢出率最高，占71.79%(28/39)，各年齡段 HBoV陽性檢出率差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.82,P=0.049)。97例RSV感染患兒平均月齡(6.95±2. 77)月，6～12月齡陽性檢出率最高，占54.64%(53/97)，各年齡段RSV陽性檢出率差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.502,P=0.682)。

HBoV全年均有檢出，無明顯季節(jié)性分布，檢出最高峰在2015年11月7例(17.4%)。RSV檢出集中于冬春季，高峰集中于2015年11月至2016年03月，6～8月是流行低谷期，檢出最高峰在2016年2月19例(65.2%)。

2.3單一HBoV感染與單一RSV感染毛支患兒臨床資料比較HBoV組更易出現(xiàn)嘔吐、腹瀉 (P<0.05)，但氣促、呼吸困難、低氧血癥(SPO2<90%)的發(fā)生率以及喘息時間、住院時間均低于RSV組(P<0.05)，采用改良的Tal評分法[6]評價HBoV單一感染組和RSV單一感染組毛支疾病嚴重程度，結(jié)果表明HBoV組中重度患兒比例低于RSV組(6.9% vs. 10.5%;P=0.012)。兩組患者在各實驗室檢查指標方面差異均無統(tǒng)計學意義 (P>0.05)。與RSV感染相比，HBoV單一感染組胸片肺氣腫影多見(P=0.046)。見表1。

3 討論

HBoV自2005 年首次在下呼吸道感染的瑞典患兒鼻咽分泌物中分離出后[2]，世界各地相繼證實HBoV的存在，并確定其為兒童呼吸道感染的重要病原體，檢出率在小兒急性下呼吸道感染中約2.7%～26.2 %，是誘發(fā)嬰幼兒喘息最常見病因之一，HBoV致病機制尚未完全闡明。本研究在對常見呼吸道病毒的檢測中，RSV檢出率最高(24.49%)，其次為HBoV(9.84%)，與國內(nèi)外研究相近[7-8]，表明HBoV在毛支患兒呼吸道分泌物中檢出率較高，提示HBoV可能是除RSV外引起毛支又一重要病毒。

表1 單一HBoV與單一RSV 感染毛支患兒臨床特征及病情嚴重程度比較

Tab.1Comparison of clinical characteristics of single HBoV and RSV infection in children with bronchiolitis

注:*連續(xù)性校正

Note:*continuity correction

在本研究發(fā)現(xiàn)HBoV感染病例存在性別差異，男性高于女性(P<0.05)。研究表明，不同年齡段患兒均會出現(xiàn)HBoV感染，但以2歲以下嬰幼兒居多。 本資料中6～ 12月齡陽性檢出率最高，而6個月以下嬰兒及2歲以上兒童感染相對較少，可能原因為6個月以下嬰兒體內(nèi)存在母源性抗體，2歲以上兒童逐漸因外界感染而使抗體滴度升高。關(guān)于HBoV感染的季節(jié)性國內(nèi)外報道不一，在歐美 HBoV感染主要集中于冬春季[9]；日本研究結(jié)果顯示72%感染主要發(fā)生在春季[10]；在我國，北京[11]報道HBoV檢測高峰主要集中于8～11月；廣州報道[12]檢出高峰在5～6月。本研究顯示HBoV全年均有檢出，無明顯季節(jié)性分布；RSV則與 HBoV不同，檢出高峰集中于冬春季，與國內(nèi)外報道流行季節(jié)基本一致。兩者流行季節(jié)的不同結(jié)果可能與地理差異、氣候特點、標本采集量及檢測方法、病毒亞型等方面有關(guān)。

HBoV陽性呼吸道標本中常有其他呼吸道病毒共同檢出[13]，在本次研究中，HBoV、RSV混合感染率分別為25.64%、11.34%，表明兩者均易發(fā)生混合感染，而HBoV較RSV更易混合其他呼吸道病毒感染(P<0.05)。HBoV的高混合感染原因可能 HBoV感染引起呼吸道局部免疫功能失調(diào)后促進了其他呼吸道病毒的侵入，另一方面也與共同感染病原體的高感染率有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)單一HBoV與單一RSV 感染毛支患兒具有相似性的主要臨床表現(xiàn), 比較發(fā)現(xiàn)HBoV感染患兒氣促、呼吸困難、低氧血癥(SPO2<90%)的臨床癥狀發(fā)生率均低于RSV組(P<0.05)，喘息持續(xù)時間、住院治療時間亦均短于RSV組(P<0.05)，兩組患兒影像學改變比較中，HBoV感染患兒胸片肺部過度充氣征相對多見(P<0.05)，以上提示 HBoV毛細支氣管炎病情可能較 RSV 輕。HBoV DNA在腹瀉患兒糞便標本中的檢出率為0.8%～9.1%，但其與輪狀病毒等引起嬰幼兒腹瀉的常見病原體共感率達21%～100%。Cheng等[14]提出HBoV或許僅為一種伴隨病毒，而不是消化道疾病的致病病原體。在我們的研究中，同樣發(fā)現(xiàn)HBoV組毛細支氣管炎患兒出現(xiàn)嘔吐、腹瀉較RSV組更多見(P<0.05)。

綜上所述，HBoV可能是引起嬰幼兒毛支的病毒病原之一，HBoV和RSV感染所致毛細支氣管炎患兒具有相似的臨床特征、實驗室及影像學改變，HBoV感染患兒病情可能較RSV輕。闡明HBoV在毛細支氣管炎病原學機制，對指導臨床上相關(guān)的預防及治療策略有重要意義,值得進一步深入研究。

利益沖突：無

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