呂書玉 趙方紅 張苗苗 劉宏乾

030002 太原，山西醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)二系(呂書玉)；050091 石家莊，河北華安生物醫(yī)藥股份有限公司(趙方紅，張苗苗，劉宏乾)

狂犬病(rabies)是由狂犬病病毒(rabies virus)引起的以中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染癥狀為主的傳染性疾病，病死率幾乎100%。人感染狂犬病病毒主要是由于被狂犬病病毒感染的動(dòng)物，主要是犬、貓，咬傷或抓傷導(dǎo)致的。對于狂犬病暴露后處置(post-exposure prophylaxis, PEP)接種狂犬病疫苗必不可少。人體接種狂犬病疫苗后，機(jī)體可以產(chǎn)生狂犬病病毒中和抗體，狂犬病病毒中和抗體水平 ≥ 0.50 IU/ml 即可認(rèn)為達(dá)到保護(hù)性抗體水平[1]。

檢測狂犬病病毒中和抗體水平的金標(biāo)準(zhǔn)是世界衛(wèi)生組織推薦的小鼠腦內(nèi)中和試驗(yàn)(mouse neutralizing test, MNT)和快速熒光灶抑制試驗(yàn)(rapid fluorescent focus inhibition test, RFFIT)[1]。MNT和RFFIT技術(shù)和操作難度較高，難以普及[2]。國內(nèi)外目前主要應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)進(jìn)行狂犬病病毒IgG抗體篩查[2-4]，應(yīng)用膠體金(colloidal gold, CG)試劑進(jìn)行狂犬病病毒IgG抗體篩查的報(bào)道資料極少。本研究探索CG試劑在狂犬病病毒IgG抗體篩查中的真實(shí)效能，為CG試劑的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1檢測樣品效價(jià)100 IU/ml的人狂犬病免疫球蛋白參考品由河北華安生物醫(yī)藥股份有限公司提供，以ddH2O制備1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50、1∶55、1∶100、1∶200、1∶300、1∶400、1∶500系列稀釋品。含100份狂犬病疫苗免疫者血清的血清盤由河北華安生物醫(yī)藥股份有限公司利用制備狂犬病免疫球蛋白的備用血漿制備并提供。

1.2主要試劑人狂犬病病毒抗體(IgG)檢測試劑盒(膠體金法)由國內(nèi)某公司生產(chǎn)。細(xì)胞培養(yǎng)液(dulbecco′s modified eagle medium, DMEM)、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)為美國Life Technologies公司產(chǎn)品。異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)標(biāo)記抗狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體FDI FUJIREBIO FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin為日本Fujirebio公司產(chǎn)品。

1.3狂犬病病毒抗體檢測

1.3.1 CG法:從密封袋中取出檢測卡，放在水平工作臺(tái)面上平置并做好樣本標(biāo)記，取10 μl血清(狂犬免疫球蛋白稀釋品)直接加入到加樣孔中，再加入100 μl(約2～3滴)樣本稀釋液，15～20 min內(nèi)判讀結(jié)果，20 min后檢測結(jié)果無效。C線和T線同時(shí)出現(xiàn)條帶判定為陽性結(jié)果，C線出現(xiàn)而T線不出現(xiàn)條帶判定為陰性結(jié)果，C線不出現(xiàn)條帶判定為無效檢測。每份樣品平行檢測2個(gè)CG試劑條，測定結(jié)果一致判斷為有效。

1.3.2 RFFIT法:按照文獻(xiàn)[5]中RFFIT操作方法進(jìn)行，抗體效價(jià) < 0.50 IU/ml判定為陰性結(jié)果，抗體效價(jià) ≥ 0.50 IU/ml判定為陽性結(jié)果。每份血清平行檢測3次，取抗體效價(jià)幾何平均值(geometric mean titer, GMT)作為最終測定結(jié)果。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Excel表格整理數(shù)據(jù)，采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，CG法和RFFIT法檢出率的比較采用四格表卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1狂犬病免疫球蛋白系列稀釋品RFFIT、CG法比較以“稀釋度(RFFIT測定值，CG法檢測結(jié)果—陽性“+”、陰性“-”)”來表示不同稀釋度狂犬病免疫球蛋白稀釋品對應(yīng)的RFFIT檢測值(IU/ml)和CG法檢測結(jié)果，依次為1∶5(19.62, +)、1∶10(9.53, +)、1∶15(6.53, -)、1∶20(5.21, -)、1∶25(3.68, -)、1∶30(3.02, -)、1∶35(3.00, -)、1∶40(2.36, -)、1∶45(2.12, -)、1∶50(1.86, -)、1∶55(1.66, -)、1∶100(0.96, -)、1∶200(0.52, -)、1∶300(0.30, -)、1∶400(0.22, -)、1∶500(0.16, -)。RFFIT測定值9.53 IU/ml(對應(yīng)1∶10稀釋度)以下的各稀釋品在CG法中均測定為陰性結(jié)果。

2.2狂犬病疫苗免疫者血清RFFIT、CG法比較采用RFFIT和CG法對100份狂犬病疫苗免疫者血清進(jìn)行檢測，RFFIT測定值 < 0.5 IU/ml的血清樣品26份，0.50 IU/ml ≤ RFFIT測定值 < 1.00 IU/ml的血清樣品18份，1.00 IU/ml ≤ RFFIT測定值 < 2.00 IU/ml的血清樣品24份，RFFIT測定值 ≥ 2.00 IU/ml的血清樣品32份。RFFIT測定值 < 2.00 IU/ml的血清樣品在CG法檢測中全部為陰性。RFFIT檢測值 ≥ 2.00 IU/ml的血清樣品在CG法檢測中有4份為陰性，這4份血清RFFIT測定值最高的為 2.80 IU/ml，其余血清樣品RFFIT測定值均 ≥ 3.30 IU/ml。

以RFFIT檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，CG法的特異性為100.00%(26/26)，假陽性率為0(0/26)；CG法的靈敏性為37.84%(28/74)，假陰性率為62.16%(46/74)。RFFIT陽性檢出率為74.00%(74/100)，CG法陽性檢出率為28%(28/100)，二者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.66,P=0.000)。見表1。

表1 快速熒光灶抑制試驗(yàn)和膠體金法檢測狂犬病病毒抗體結(jié)果比較Tab.1 Comparision of the results of rabies virus antibodies tested by rapid fluorescent focus inhibition test and colloidal gold method

3 討論

我國是全球第二大狂犬病流行國家，每年P(guān)EP消耗人用狂犬病疫苗1 000～1 500萬人份[6]。檢測狂犬病疫苗接種者血清內(nèi)狂犬病病毒抗體可以評價(jià)PEP的有效性，在某些情況下具有一定的現(xiàn)實(shí)意義[7]。CG法只能定性檢測狂犬病病毒抗體，操作便捷、不依賴實(shí)驗(yàn)室，適合進(jìn)行狂犬病病毒抗體初步篩查使用[4]。本研究顯示CG法對陽性血清有漏檢，對陰性血清無漏檢，也就是只有假陰性而沒有假陽性結(jié)果，出現(xiàn)假陰性結(jié)果的血清狂犬病病毒中和抗體效價(jià)不超過2.80 IU/ml。兒童、老年人、艾滋病患者等免疫力低下人群容易出現(xiàn)接種狂犬病疫苗后血清狂犬病病毒中和抗體水平較低的情況，對于此類人群要謹(jǐn)慎解讀CG法篩查時(shí)出現(xiàn)的陰性結(jié)果[8]。

本研究設(shè)立系列狂犬病免疫球蛋白稀釋品界定CG法檢測狂犬病病毒抗體的下限，即檢測靈敏性，結(jié)果顯示CG法檢測下限高于6.53 IU/ml 而低于9.53 IU/ml。然而，CG法檢測血清時(shí)顯示的檢測下限高于2.80 IU/ml但是低于3.30 IU/ml，這與狂犬病免疫球蛋白稀釋品界定CG法檢測下限差距明顯，這說明血清中除外狂犬病病毒中和抗體的某些其他成分對CG法檢測有未知影響，還有待深入研究其原因。同時(shí)，CG法檢測并未出現(xiàn)假陽性結(jié)果，說明血清中除外狂犬病病毒中和抗體的其他成分可能不會(huì)導(dǎo)致CG法檢測出現(xiàn)假陽性結(jié)果，值得后續(xù)增加樣品量作進(jìn)一步研究。

ELISA法檢測血清狂犬病病毒抗體時(shí)假陽性和假陰性結(jié)果并存，通過改進(jìn)包被抗原質(zhì)量等手段可以提高ELISA法檢測狂犬病病毒抗體的效能，降低假陽性率和假陰性率[9-11]。影響狂犬病病毒抗體CG法試劑檢測靈敏性的主要因素是包被抗原的質(zhì)量，改進(jìn)包被抗原可以提高其檢測靈敏性，同時(shí)應(yīng)注意是否會(huì)出現(xiàn)檢測假陽性的問題。我國《狂犬病暴露預(yù)防處置工作規(guī)范(2009年版)》明確MNT、RFFIT是個(gè)體進(jìn)行狂犬病疫苗免疫后抗體檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法[12]。應(yīng)用CG法進(jìn)行狂犬病病毒抗體篩查應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格把握適用情況和科學(xué)解讀結(jié)果，必要時(shí)使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行復(fù)核，這點(diǎn)應(yīng)當(dāng)給予足夠重視。

利益沖突:無

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