楊艷琳 劉明 鄧櫻 郭艷 張緒清 向德棟 蔣黎 游忠嵐 伍藝 李茂仕 毛青

400038 重慶，陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))西南醫(yī)院全軍感染病研究所感染病研究重慶市重點實驗室

乙型病毒性肝炎(hepatitis B virus, HBV)呈世界性流行，據(jù)估計全球HBsAg攜帶者有2.4億人，每年有近1百萬人死于HBV相關(guān)性疾病[1-2]。早期獲得HBsAg清除可降低患者發(fā)生肝硬化、肝癌的風(fēng)險[3]。但是，臨床上HBsAg清除率很低，干擾素和核苷(酸)類似物(nucleos(t)ide analogue, NAs)治療的HBsAg清除率分別為3%～7%/年、0%～3%/年[1]。研究發(fā)現(xiàn)干擾素治療時通過優(yōu)化CHB患者的基線特征可提高HBsAg清除率，如OSST研究和NEW SWITCH研究發(fā)現(xiàn)NAs經(jīng)治的CHB患者基線HBsAg <1500 IU/ml時序貫接受PegIFN治療后HBsAg清除率分別為22.2%、28.5%[4-5]。因此研究HBsAg清除的影響因素對于改進CHB治療具有重要意義。MicroRNA(miRNA)作為生物體內(nèi)源性基因表達調(diào)控分子(19～23nt)，等研究報道，其可參與HBV治療的免疫應(yīng)答、影響病毒復(fù)制如miR-199 a-3p和miR-210分別靶向HBsAg和pre-S1編碼區(qū)從而降低HBsAg的表達水平[6]。由于細胞中miRNA表達水平相對于血漿、血清較穩(wěn)定和肝組織標本難以獲取等原因，不容易受其他因素的影響，故本研究選擇外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中的差異miRNAs作為研究對象。

1 對象與方法

1.1研究對象從2015年4月30日開始從重慶西南醫(yī)院門診招募符合入組要求的病例，隨訪觀察PegIFN應(yīng)答結(jié)局。研究對象入組標準為：①年齡18～65歲；②HBsAg陽性至少6個月，基線HBsAg水平 < 1500 IU/ml，HBeAg(-)，HBV DNA < 1000IU/ml；③ALT ≤ 2ULN(正常值上限，我們醫(yī)院為42IU/ml)；④干擾素初治，核苷(酸)經(jīng)治或者未治療。排除標準：①合并感染HAV、HCV、HDV、HEV、HIV；②有酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、藥物性肝炎、自身免疫性肝病等其他慢性肝病的證據(jù)；③近6個月內(nèi)接受免疫調(diào)節(jié)藥物治療；④有生育計劃。所有患者入組前均簽署知情同意書，該研究已通過西南醫(yī)院倫理委員會批準，并在中國臨床試驗注冊中心注冊(注冊號ChiCTR-ROC-16008735)。

1.2治療方案招募的患者接受PegIFNα-2 a治療(180 μg/w)，療程至少48周，單藥或者聯(lián)合NAs治療，最終療程及藥物劑量由門診醫(yī)師根據(jù)患者具體病情決定，但不超過96周。若干擾素治療后HBsAg無明顯下降甚至上升，可提前終止治療，停藥后每3個月進行復(fù)查隨訪。

1.3實驗室檢測方法

1.3.1 臨床指標檢測：乙肝標志物用Abbott公司配套試劑盒進行檢測，HBsAg檢測范圍為0.05 IU/ml～> 250 IU/ml，HBsAg < 0.05 IU/ml認為是HBsAg清除。血清HBV DNA運用上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司的試劑盒進行檢測，HBV DNA檢測下限為<500 IU/ml；全自動生化儀(7600-020，HITACHI公司)測定血清ALT、TBIL、ALB水平；全自動五分類血液分析儀(XT-2000i，Sysmex公司)測定WBC、PLT。

1.3.2 總RNA提?。和庵莒o脈血PBMC用淋巴細胞分離液(LymphoprepTM)分離，胎牛血清重懸(HyCloneTM, Cat.N:SV30087.03)儲存在液氮中備用。PBMC的總RNA根據(jù)Qiagen試劑盒說明書提取(Cat No/ID: 217004)，RNA的濃度及質(zhì)量用Nano Drop 2 000 C分光光度計進行檢測并進行凝膠電泳。

1.3.3 miRNAs芯片檢測:芯片檢測委托上?？党缮锕就瓿?，芯片根據(jù)miRCURYTMHy3TM/Hy5TMPower labeling(Exiqon, Vedbaek, Denmark, Cat#208032-A)和miRCURYTM LNA Array(v.19.0)(Exiqon)試劑盒說明書進行標記和雜交。圖像掃描導(dǎo)入GenePix Pro 6.0(Axon)軟件進行數(shù)據(jù)提取，根據(jù)以下標準篩選兩組間差異表達的miRNAs：差異倍數(shù)>1.5,P< 0.05。

1.3.4 miRNAs的實時熒光定量:根據(jù)miRNA在兩組間的表達差異程度，選擇差異倍數(shù) > 3,P< 0.05的前7條miRNAs進行實時熒光PCR定量驗證，其中3條上調(diào)，4條下調(diào)。實驗過程按照microRNA通用定量試劑盒說明書進行(Cat#GMRS-001,吉瑪基因,上海)。熒光定量上游引物序列見表1，差異miRNAs的表達水平用ΔCT方法表示(ΔCT=CT目標miRNA - CT內(nèi)參U6)。

1.3.5 差異miRNAs的靶向基因預(yù)測:使用TargetScan 7.1和miRDB V5.0在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測差異表達的miRNAs靶基因，對預(yù)測到的所有靶基因根據(jù)以下原則進行排序篩選：TargetScan 7.1數(shù)據(jù)庫靶基因cumulativeWeightedContext++Score ≤-0.3，miRDB V5.0數(shù)據(jù)庫靶基因targetScore ≥ 70。并對預(yù)測到的靶向基因進行生物信息學(xué)分析，即Pathway分析，預(yù)測其與HBsAg清除潛在的聯(lián)系。

表 1 miRNAs引物序列

Tab.1Primers sequence of miRNAs

表2 研究隊列的基線特征

Tab.2Baseline characteristic of study cohort

基線特征篩選隊列(n=20)驗證隊列(n=47)清除組未清除組P清除組未清除組P例數(shù)1010—1730—男，例數(shù)(%)9(90)7(70)058215(88)24(80)0692a年齡，歲29±89464±6800001???39±77387±930921既往用NAs史——————是67110220305否43—78—HBVDNA，IU/ml——————低于檢測于下限(<500)79058216230228500～100031—17—b基線HBsAg，IU/ml18609(2931?72435)18428(6275?53669)111654(3336?19526)50436(15635?87549)001<500，No．(%)770549＄1415009＄500～1000，No．(%)23—210—1000～1500，No．(%)10—15—a基線ALT，IU/ml364±17833069±9903883151±1403721±30650474

$a`=(2*a)/[k*(k-1)+1]=0.014,k=3,a=0.05; i*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001

a數(shù)據(jù)用均值±標準差表示;b數(shù)據(jù)用中位數(shù)表示(四分位間距)；ALT谷丙轉(zhuǎn)氨酶；既往用藥史，表示干擾素治療前是否用核苷(酸)類似物治療，NAs包括所有常規(guī)抗病毒藥物：替諾福韋酯，恩替卡韋，拉米夫定，替比夫定，阿德福韋酯等，可以單藥或者聯(lián)合用藥，平均用藥時間是64.60周 (33.3-82.97)(中位數(shù)-四分位間距)

$a`=(2*a)/[k*(k-1)+1]=0.014,k=3,a=0.05;*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001;

Notes.adata are presented as mean±SD;bdata are presented as median (IQR range); ALT denotes alanine aminotransferase; WBC, white blood count; History of NAs means whether they have used nucleos(t)ide analogs (NAs) before PegIFN treatment, the NAs include all kinds of conventional medicines: TDF, ETV, LAM, LdT, ADV. They were used by means of monotherapy or combined treatment. The median duration time of NAs was 64.60 w (33.3-82.97) (median±IQR)

1.4統(tǒng)計學(xué)方法所有統(tǒng)計分析運用SPSS 23.0軟件進行分析。兩組之間的差異比較用卡方檢驗或者Fisher精確概率檢驗方法，獨立樣本t檢驗，曼-惠特尼U檢驗。雙側(cè)檢驗P< 0.05表示兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1基線特征本研究病例數(shù)共67例，分成兩個隊列：篩選隊列(n=20例)和驗證隊列(n=47例)。停藥時HBsAg水平低于0.05 IU/ml認為是HBsAg清除，在表面抗原清除組中，有21例獲得HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，各基線參數(shù)在兩隊列中差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，如性別、基線HBV DNA、ALT，但在篩選隊列中年齡差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，基線特征詳見表2。

2.2芯片結(jié)果篩選隊列中10例HBsAg清除與10例未清除患者PBMC抽提的總RNA與miRNA芯片雜交后，獲得差異miRNAs芯片圖像。結(jié)果顯示兩組間存在明顯miRNAs差異表達(差異倍數(shù) > 1.5，P< 0.05)：共417條miRNAs差異表達，其中在清除組上調(diào)的有342條，如miR-196b-3p, miR-548ah-5p, miR-5583, miR-122；下調(diào)的有75條，如miR-3960, miR-126-3p, miR-146 a, miR-199 a。

2.3差異miRNAs的驗證對選擇的7條差異顯著的miRNAs在驗證隊列中進行實時熒光定量驗證，驗證隊列由17例HBsAg清除和30例HBsAg未清除病例組成。結(jié)果顯示有4條miRNAs(miR-3960, miR-126-3p, miR-23 a-3p, miR-335-5p)在驗證隊列中有統(tǒng)計學(xué)差異(P< 0.05)，四條均在HBsAg清除組下調(diào)，其余3條miR-196b-3p, miR-548ah-5p, miR-5583差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)，各條差異miRNAs相對表達水平見圖1。

圖1 差異miRNAs的相對表達水平，相對表達水平用ΔCT法表示：ΔCT=CT目標miRNA-CT 內(nèi)參U6Fig.1 The relative expression levels of the differential miRNAs between the two groups. The relative level is shown as ΔCT (ΔCT=CT of interest miRNA-CT of internal control U6)

2.4差異miRNAs靶基因預(yù)測對miR-3960, miR-126-3p, miR-23 a-3p和miR-335-5p通過在線數(shù)據(jù)庫TargetScan 7.1和miRDB V5.0預(yù)測靶基因，并取兩數(shù)據(jù)庫重復(fù)出現(xiàn)的部分，篩選出可能與HBsAg清除免疫應(yīng)答相關(guān)的靶基因。結(jié)果顯示miRNAs的可能靶基因與免疫調(diào)節(jié)等生物過程相關(guān)，如CCL-7、IGSF8、CASP7等。

2.5差異miRNAs靶基因功能預(yù)測對差異miRNAs的靶基因進行通路分析，探究其可能參與的生物過程，其中4條差異microRNAs的靶向基因相關(guān)的信號通路包括AMPK信號通路、NOD樣受體信號通路、NF-kappa B信號通路、mTOR通路等。

3 討論

本研究通過前瞻性建立PegIFN治療隊列，獲得不同應(yīng)答組之間差異表達的miRNAs，為了排除病毒、宿主免疫因素對HBsAg清除的影響，本研究選擇肝功能正常、低基線HBsAg和低病毒載量的CHB患者。研究發(fā)現(xiàn)CHB的不同感染階段具有不同的miRNA表達模式[7]，這可能與他們不同的免疫狀態(tài)相關(guān)。我們推測經(jīng)PegIFN治療后獲得HBsAg清除的患者，可能在治療前已經(jīng)處于一種有利于免疫清除的狀態(tài)，經(jīng)PegIFN的免疫調(diào)節(jié)推動作用后進一步發(fā)生HBsAg清除，而用藥前差異表達的miRNAs可能與這種免疫狀態(tài)相關(guān)。在驗證出的4條miRNAs中，miR-3960被報道可與長非編碼RNA HOTAIRMI競爭性結(jié)合調(diào)節(jié)單核細胞/樹突狀細胞(dendritic cell，DC)的分化[8]，DC作為專性抗原提呈細胞在抗原加工、處理、呈遞過程中具有重要作用，是連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的紐帶。4條差異miRNAs靶基因的通路分析結(jié)果顯示與多個重要信號通路相關(guān)，如AMPK信號通路、NOD樣信號通路、NF-kappa B信號通路、mTOR通路等。AMPK是生物能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子，通過調(diào)節(jié)組織器官的能量代謝進而影響機體功能，研究發(fā)現(xiàn)AMPK信號可影響T細胞的激活和細胞因子的產(chǎn)生[9]，而NF-kappa B被報道在腫瘤早期發(fā)展的免疫監(jiān)視過程中具有重要作用[10]。另外miR-126-3p[11], miR-23 a-3p[12]和miR-335-5p[13]均被報道與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)，而免疫系統(tǒng)對于腫瘤的監(jiān)視發(fā)揮重要作用，免疫系統(tǒng)的失調(diào)可能導(dǎo)致腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。綜合相關(guān)文獻報道及差異miRNAs靶基因、信號通路的分析，我們推測miRNAs可能通過調(diào)控免疫相關(guān)基因的表達，增強HBV清除相關(guān)的免疫應(yīng)答，促進HBsAg清除。

miRNAs除了調(diào)控免疫因素外，也可能通過直接抑制HBV DNA的復(fù)制或者靶向HBsAg轉(zhuǎn)錄本降低HBsAg水平。例如miR-199 a-3p，miR-122，miR-146 a在芯片結(jié)果中差異表達，研究報道m(xù)iR-199 a-3p與HBsAg編碼區(qū)特定位點結(jié)合降低HBsAg的表達水平[7]；miR-122作為肝細胞特異表達的miRNA,可抑制HBV DNA的復(fù)制[14]，而miR-146 a通過下調(diào)肝細胞內(nèi)STAT1損傷IFN誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答能力[15]。本研究選擇的7條miRNAs中，miR-548ah-5p, miR-196b-3p和miR-5583在驗證隊列中未驗證出差異，可能是該基因本身表達量低以致芯片檢測結(jié)果容易出現(xiàn)假陽性，或者是驗證樣本量較少的結(jié)果。

綜上所述，miRNA對HBsAg清除具有一定的研究價值，miRNA可能通過調(diào)節(jié)免疫相關(guān)基因的表達、直接抑制HBV DNA復(fù)制或者HBsAg轉(zhuǎn)錄本的翻譯獲得HBsAg清除。本研究尚存在不足之處：整個研究隊列的樣本數(shù)較少，需要進一步擴大樣本進行驗證；另外缺乏對差異miRNAs的靶基因的具體分子機制的研究，這將是我們今后的研究方向。

利益沖突:無

參考文獻

[1] Lampertico P, Agarwal K, Berg T, et al. EASL 2017 Clinical Practice Guidelines on the management of hepatitis B virus infection[J]. J Hepatol, 2017,67(2):370-398. DOI: 10.1016/j.jhep.2017.03.021.

[2] Sarin SK, Kumar M, Lau GK, et al. Asian-Pacific clinical practice guidelines on the management of hepatitis B: a 2015 update[J]. Hepatol Int, 2016,10(1):1-98. DOI: 10.1007/s12072-015-9675-4.

[3] Tseng TC, Liu CJ, Yang HC, et al. Serum hepatitis B surface antigen levels help predict disease progression in patients with low hepatitis B virus loads[J]. Hepatology, 2013,57(2):441-450. DOI: 10.1002/hep.26041.

[4] Ning Q, Han M, Sun Y, et al. Switching from entecavir to PegIFN alfa-2a in patients with HBeAg-positive chronic hepatitis B: A randomised open-label trial (OSST trial)[J]. J Hepatol, 2014,61(4):777-784.DOI: 10.1016/j.jhep.2014.05.044.

[5] Increased and sustained HBsAg loss in HBeAg positive CHB patients switched from NUC to Peg-IFN alfa-2a: A randomised open label trial (NEW SWITCH study).2014, AASLD, LB-10.

[6] Zhang G, Li Y, Zheng S, et al. Suppression of hepatitis B virus replication by microRNA-199a-3p and microRNA-210[J]. Antiviral Res, 2010,88(2):169-175.DOI: 10.1016/j.antiviral.2010.08.008.

[7] Ji F, Yang B, Peng X, et al. Circulating microRNAs in hepatitis B virus-infected patients[J]. J Viral Hepat, 2011,18(7):e242-e251.DOI: 10.1111/j.1365-2893.2011.01443.x.

[8] Xin J, Li J, Feng Y, et al. Downregulation of long noncoding RNA HOTAIRM1 promotes monocyte/dendritic cell differentiation through competitively binding to endogenous miR-3960[J]. Onco Targets Ther, 2017,Volume 10:1307-1315. DOI: 10.2147/OTT.S124201.

[9] Rao E, Zhang Y, Li Q, et al. AMPK-dependent and independent effects of AICAR and compound C on T-cell responses[J]. Oncotarget, 2016,7(23):33783-33795.DOI: 10.18632/oncotarget.9277.

[10] Ratnam NM, Peterson JM, Talbert EE, et al. NF-κB regulates GDF-15 to suppress macrophage surveillance during early tumor development[J]. J Clin Invest, 2017, 127(10):3796-3809. DOI: 10.1172/JCI91561.

[11] Du C, Lv Z, Cao L, et al. MiR-126-3p suppresses tumor metastasis and angiogenesis of hepatocellular carcinoma by targeting LRP6 and PIK3R2[J]. J Transl Med, 2014,12(1):259. DOI: 10.1186/s12967-014-0259-1.

[12] Wen Y, Lee W, Tan P, et al. By inhibiting snail signaling and miR-23a-3p, osthole suppresses the EMT-mediated metastatic ability in prostate cancer[J]. Oncotarget, 2015,6(25):21120-21136. DOI10.18632/oncotarget.4229.

[13] Wang Y, Yang T, Zhang Z, et al. Long non-coding RNA TUG1 promotes migration and invasion by acting as a ceRNA of miR-335-5p in osteosarcoma cells[J]. Cancer Sci, 2017,108(5):859-867. DOI:10.1111/cas.13201.

[14] Qiu L, Fan H, Jin W, et al. miR-122-induced down-regulation of HO-1 negatively affects miR-122-mediated suppression of HBV[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2010,398(4):771-777. DOI: 10.1016/j.bbrc.2010.07.021.

[15] Hou Z H, Han Q J, Zhang C, et al. miR146a impairs the IFN-induced anti-HBV immune response by downregulating STAT1 in hepatocytes[J]. Liver Int, 2014,34(1):58-68. DOI: 10.1111/liv.12244.