李潔 何小周 楊夢婕 馬學(xué)軍 武桂珍

102206 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所

中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所(以下簡稱病毒病所)擔(dān)負(fù)著研究新的實(shí)驗(yàn)方法，建立與制定標(biāo)準(zhǔn)，技術(shù)指導(dǎo)全國病毒病防控工作等任務(wù)。有些實(shí)驗(yàn)方法需要提升到國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)高度。其中一些非標(biāo)方法(自制方法)相比于國標(biāo)方法、行標(biāo)方法具有獨(dú)特的優(yōu)勢。通過檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定工作(又稱實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)認(rèn)定)，可以將這些成熟的方法通過資質(zhì)認(rèn)定的法定程序予以確認(rèn)，進(jìn)而轉(zhuǎn)化成為本所標(biāo)準(zhǔn)，使用該方法得到的檢測結(jié)果就具備了一定的法律效力[8,13]。

1 方法確認(rèn)的依據(jù)

按照實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)認(rèn)定評審準(zhǔn)則的要求[1-4]，對非標(biāo)方法進(jìn)行技術(shù)確認(rèn)的主要原則應(yīng)包含：(1)使用參考標(biāo)準(zhǔn)或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行比較；(2)與其他方法所得的結(jié)果進(jìn)行比較；(3)實(shí)驗(yàn)室間檢測結(jié)果的比對；(4)對影響結(jié)果的因素作系統(tǒng)性評審；(5)根據(jù)對實(shí)驗(yàn)方法理論原理和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的科學(xué)理解，對所得結(jié)果不確定度進(jìn)行評定。

非標(biāo)方法的確認(rèn)除其他程序完備外，一般需要有三個或以上的比對試驗(yàn)，可以有以下幾種辦法：1)組織學(xué)術(shù)評審會，邀請專家，通過學(xué)術(shù)評審確定方法的可行性、適應(yīng)性和有效性。2)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)方法確認(rèn)(in-house method validation):同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，在合理的時(shí)間間隔內(nèi)，用一種方法在預(yù)定條件下對相同或不同測試樣品進(jìn)行的分析實(shí)驗(yàn)。亦可由本室不同人員通過留樣再測，進(jìn)行不同批次的實(shí)驗(yàn)比對[5-7,11]。3)實(shí)驗(yàn)室間方法確認(rèn)(inter-laboratory method validation)是指在兩個或多個實(shí)驗(yàn)室之間實(shí)施的方法確認(rèn)。各實(shí)驗(yàn)室依照預(yù)定條件用相同方法對相同樣品進(jìn)行測定。包括在本所或外所不同的實(shí)驗(yàn)室對該方法進(jìn)行重復(fù)，以實(shí)現(xiàn)在不同地點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)比對[5-7,11]。4)與其他標(biāo)準(zhǔn)方法比對。5)與標(biāo)準(zhǔn)品檢測結(jié)果比對。結(jié)合資質(zhì)認(rèn)定《檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定評審準(zhǔn)則》(國認(rèn)實(shí)[2016]33號)[3]和國際標(biāo)準(zhǔn)《檢測或校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則》ISO/IEC：17025的規(guī)則要求，本研究就比對方法進(jìn)行梳理[5-7]。需要說明的是，下述介紹的各種比對結(jié)果評價(jià)中，要用到一個重要的參數(shù)是測量不確定度，而對于病毒學(xué)方法的的評價(jià)指標(biāo)主要是特異性，穩(wěn)定性和可靠性等，難以套用測量不確定度的計(jì)算公式，病毒學(xué)方法應(yīng)該依照資質(zhì)認(rèn)定的原則框架進(jìn)行比對試驗(yàn)，但具體判定規(guī)則應(yīng)按照本專業(yè)規(guī)則和圖表進(jìn)行判定和表達(dá)。

2 比對方法(試驗(yàn))[9-14]

2.1人員比對在相同的環(huán)境條件下，采用相同的檢測方法、相同的檢測設(shè)備和設(shè)施，由不同的檢測人員對同一樣品進(jìn)行檢測的試驗(yàn)。以參與比對試驗(yàn)人員中具有較高準(zhǔn)確度一方的測定值作為參考值，比對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行評價(jià)。

2.2方法比對在環(huán)境條件相同的前提下，由相同的人員采用不同的檢測方法對同一樣品進(jìn)行的檢測,對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行評價(jià)。

2.3儀器比對在相同的環(huán)境條件下、使用相同的方法、由相同的檢測人員采用不同的儀器設(shè)備對同一樣品進(jìn)行檢測的試驗(yàn)。

2.4留樣再測在盡可能相同的環(huán)境條件下，采用相同的檢測方法、相同的檢測設(shè)備和設(shè)施，由相同的檢測人員對已完成檢測的樣品在其留樣保存期間進(jìn)行再次檢測的試驗(yàn)。

3 實(shí)證案例

以“RT-RAA法檢測 EV71/ CA16等病毒”方法為例，說明方法確認(rèn)研究的要素。結(jié)合具體方法的實(shí)際情況，對原方法做適當(dāng)驗(yàn)證，補(bǔ)充和修正。

按照《檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定評審準(zhǔn)則》(國認(rèn)實(shí)[2016]33號)4.5.14要求。 按照病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量體系文件《檢測方法控制程序》的要求，進(jìn)行比對試驗(yàn)驗(yàn)證，具體使用的方法是留樣再測，人員比對。通過比對確認(rèn)該方法的敏感性、特異性、穩(wěn)定性，可靠性符合預(yù)期?！癛T-RAA法檢測 EV71/CA16等病毒”方法采用了以下形式進(jìn)行比對試驗(yàn)驗(yàn)證：由不同檢測人員非同一日對留樣進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)操作，3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陰性對照無擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，陽性對照和樣品有明顯的擴(kuò)增曲線，因此3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)樣品結(jié)果均判讀為CA16。通過比對確認(rèn)該方法的特異性、穩(wěn)定性和可靠性符合預(yù)期。

4 確認(rèn)后的方法

調(diào)整后的“RT-RAA法檢測 EV71/CA16等病毒”方法[8]從形式上提升為病毒病所所內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)；程序上符合了實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)認(rèn)定的方法確認(rèn)程序；內(nèi)容上增加了技術(shù)要求、結(jié)果分析、檢驗(yàn)規(guī)則、判定規(guī)則等條款。以下引用修改后的該標(biāo)準(zhǔn)：

——————中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所《標(biāo)準(zhǔn)》。標(biāo)準(zhǔn)編號：Q/IVDC024005-2017，標(biāo)準(zhǔn)名稱：《RT-RAA法檢測 EV71/ CA16等病毒》，發(fā)布時(shí)間2017年12月25日。

前言

關(guān)于本標(biāo)準(zhǔn)的基本概況：手足口病是人腸道病毒引起的一種兒童常見傳染病。引發(fā)手足口的病毒以腸道病毒71型和柯薩奇病毒A16型為主。傳統(tǒng)的檢測方法如多重PCR法和定量PCR法對硬件設(shè)備和操作人員的技術(shù)要求較高，且成本也高，故建立該快速準(zhǔn)備易普及的檢測方法，對現(xiàn)場突發(fā)事件及實(shí)驗(yàn)室大量檢測任務(wù)具有重大意義。根據(jù)《中華人民共和國標(biāo)準(zhǔn)化法》、《中華人民共和國產(chǎn)品質(zhì)量法》特制訂本產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)作為該檢測方法的質(zhì)量依據(jù)。

本標(biāo)準(zhǔn)由中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所中心實(shí)驗(yàn)室提出

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：馬學(xué)軍，王佶，楊夢婕，何小周

1 范圍

本標(biāo)準(zhǔn)建立了EV71/CA16等病毒的等溫核酸擴(kuò)增方法，提高病原微生物快速檢測能力。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于經(jīng)過生物安全培訓(xùn)的操作人員進(jìn)行EV71/CA16等病毒感染病例標(biāo)本的檢測。

2 規(guī)范性引用文件

下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

Use of a rapid reverse-transcription recombinase aided amplificationassay for respiratory syncytial virus detection. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease,chenChen,xuejunMa,et al. Available online 14 October 2017.

3 定義和術(shù)語

下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(Recombinase Aided Amplification，RAA)是一種利用重組酶、單鏈結(jié)合蛋白、DNA聚合酶在39 ℃等溫條件下對核酸進(jìn)行擴(kuò)增的技術(shù)，使用該技術(shù)在短時(shí)間內(nèi)即可將目的基因擴(kuò)增放大到幾百萬倍，達(dá)到可以用儀器檢測到的水平。

逆轉(zhuǎn)錄(Reverse Transcription，RT)提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA為模板，利用引物和逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

柯薩奇病毒A組16型(Coxsackievirus A16，CA16)是一種腸道病毒，導(dǎo)致手足口病的主要病原體之一。

腸道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)是一種腸道病毒，引起嬰幼兒手足口病主要病原體之一。

4 技術(shù)要求(檢測方法)

4.1 試劑耗材及主要儀器設(shè)備

Qiagen QIAamp Viral RNA Mini Kit(catalog #52904)；RT-RAA核酸擴(kuò)增試劑盒(熒光法)；DEPC處理水(無RNA酶和DNA酶)；1.5 ml離心管,0.2 ml PCR反應(yīng)管；200 μl、100 μl、10 μl帶濾芯的TIP；奇天基因熒光基因檢測儀(QT-RAA-F7200)；

RAA 8連管混勻儀(RAA-B3208)；恒溫核酸擴(kuò)增儀(RAA-F1620)。

4.2 操作步驟

4.2.1 病毒核酸提取(具體操作見試劑盒說明書)

4.2.2 開啟熒光基因檢測儀，溫度調(diào)節(jié)至39 ℃

4.2.3 按反應(yīng)體系配制表配制反應(yīng)體系(單個樣品/反應(yīng))；混勻并離心；

4.2.4 將混合好的上述溶液加入到反應(yīng)干粉管；向反應(yīng)干粉管的蓋子上加入2.5 μl醋酸鎂；向上述溶液中加入2 μl樣本RNA，充分混勻并離心收集；

組分用量(μl)反應(yīng)緩沖液25正向引物(10μmol/L)21反向引物(10μmol/L)21探針(10μmol/L)06雙蒸水157

4.2.5 將反應(yīng)管放入熒光基因檢測儀反應(yīng)30 min進(jìn)行擴(kuò)增，并實(shí)時(shí)觀察結(jié)果。反應(yīng)程序：39 ℃，30 min；

5 結(jié)果分析

空白對照和陰性對照均無擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，陽性品有明顯的擴(kuò)增曲線。

6 檢驗(yàn)規(guī)則

需滿足以下質(zhì)量控制要求，檢驗(yàn)有效：空白對照陰性，陰性對照陰性，陽性對照陽性。

7 判定規(guī)則

從擴(kuò)增曲線判斷，有明顯擴(kuò)增曲線的樣品判定為EV71或者CA16陽性。

綜上所述，通過建立、驗(yàn)證與確認(rèn)方法，以及對“RT-RAA法檢測 EV71/ CA16等病毒”方法的實(shí)證研究，探索了病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)室基于實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)認(rèn)定條件下非標(biāo)方法建立、確認(rèn)、驗(yàn)證、核查等一系列問題，同時(shí)嘗試將非標(biāo)方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化改造，以拓展非標(biāo)方法的使用范圍，提升其嚴(yán)謹(jǐn)性，為病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)室非標(biāo)方法的確立與標(biāo)準(zhǔn)化提供了具體的實(shí)證樣本。

利益沖突：無

參考文獻(xiàn)

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[11] ISO/IEC指南99：方法確認(rèn)—2007，2.45.

[12] ISO/IEC指南99：方法驗(yàn)證—2007，2.44.

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