黃騰達(dá) 周文亭 曹經(jīng)瑗 畢勝利

102206 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所

甲型肝炎病毒(hepatitis A virus, HAV)是引起急性甲型肝炎的病原體，通過污染的水和食物及人群日常接觸經(jīng)糞口途徑傳播。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，全球每年約有150萬HAV感染病例[1]。HAV屬小RNA病毒科，肝病毒屬，基因組全長約7.5 kb，為單股正鏈RNA，包括5′非翻譯區(qū)、3′非翻譯區(qū)和一個(gè)開放讀碼框(opening reading frame, ORF)，編碼2 227個(gè)氨基酸殘基的多聚蛋白，經(jīng)蛋白酶裂解為P1、P2及P3。其中P1區(qū)編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1-VP4，P2和P3區(qū)編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，進(jìn)一步水解為2 A、2B、2C和3A、3B、3C、3D。根據(jù)VP1-2 A連接區(qū)的核苷酸序列差異，將HAV分為六個(gè)基因型(I-VI)。感染人的HAV主要為I、II、III型，進(jìn)一步分為A、B兩個(gè)亞型[1]?；蚍中脱芯勘砻?，我國流行的HAV為基因I型，其中絕大部分屬IA亞型[2]。目前HAV只有一種血清型，結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)氨基酸序列十分保守，其抗原中和位點(diǎn)主要位于結(jié)構(gòu)蛋白VP3和VP1區(qū)[3]。

由于病毒RNA缺乏校正功能，在復(fù)制過程中形成同源性很高的基因序列群體，即準(zhǔn)種(quasispecies)[4]。HAV準(zhǔn)種及全序列分析將有利于甲肝病毒暴發(fā)流行的溯源研究。本研究對(duì)我國某地3株病毒的VP1-2 A區(qū)分型一致的序列進(jìn)行了分析，成功擴(kuò)增了HAV病毒近全長序列，并進(jìn)一步分析準(zhǔn)種特征，以了解相關(guān)序列的遺傳特征。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源及試劑收集2014年我國某地抗HAV-IgM陽性甲肝急性期患者血清標(biāo)本3份(KH6.14、KH7.14、KH8.14),標(biāo)本采集獲患者知情同意?？笻AV-IgM試劑盒購自北京萬泰公司；病毒核酸提取、質(zhì)粒小提試劑盒購自O(shè)mega公司；DNA膠回收試劑盒購自QIAgen公司，RNasin購自Promega公司，逆轉(zhuǎn)錄酶SuperScript III購自Invitrogen公司；Premix Taq購自TaKaRa公司。

1.2引物設(shè)計(jì)和合成根據(jù)HAV全長序列，分9段設(shè)計(jì)18對(duì)引物。其中5′-UTR區(qū)分兩段分別采用巢式擴(kuò)增：第一段：F1(1-21)：5′-TTCAAGAGGGGTGTCCGGAGT-3′; NR1(470-450): 5′-AATATCCGCCGCTGTTACCCT-3′; F2(18-38): 5′-GGAATTTCCGGAGTCCCTCTT-3′; NR2(451-429): 5′-CTATCCAAGGCATCTCTTCATAG-3′。第二段：NF1(341-361): 5′-CACCTTGCAGTGTTAACTTGG-3′; R1(786-768): 5′-GGTCAAGGCCACTCCCAAC-3′; NF2(367-388): 5′-ATGAACCTCTTTGATCTTCCAC-3′; R2(707-688): 5′-AATGCCCCTGAGTACCTCAG-3′。引物序列位置參照參考株HM175，其余片段引物序列參照文獻(xiàn)[5]，由華大基因公司合成引物。

1.3病毒核酸提取、逆轉(zhuǎn)錄取140 μl血清標(biāo)本，按試劑盒說明書提取HAV RNA，分別溶解于40 μl焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水中。取11 μl RNA模板，加入1 μl(20 μmol/L)外側(cè)下游引物R7或R15[5]，1 μl(10 mmol/L)dNTPs，65 ℃加熱5 min，取出立即冰浴5 min，按SuperScript III逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，依次加入5×Frist-Strand Buffer、0.1 M DTT、RNasin和逆轉(zhuǎn)錄酶，配制20 μl反應(yīng)體系，55 ℃水浴1 h，然后70 ℃加熱15 min終止反應(yīng)。

1.4巢式PCR擴(kuò)增目的片段取5 μl cDNA產(chǎn)物，加入25 μl Premix Taq，外側(cè)上下游引物(10 μmol/L)各2 μl，16 μl DEPC處理水，構(gòu)成50 μl反應(yīng)體系，進(jìn)行一輪PCR，反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s, 50 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s～90 s, 共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。取一輪PCR產(chǎn)物2 μl，使用內(nèi)側(cè)上下游引物，進(jìn)行二輪PCR反應(yīng)。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的條帶，由擎科生物公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.5VP1-2A區(qū)克隆測(cè)序膠回收純化HAV VP1-2 A區(qū)PCR產(chǎn)物片段(nt 2208-3286)，按pMD19-T Vector說明書將純化產(chǎn)物與載體連接，轉(zhuǎn)化到Trans5α大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞中，根據(jù)藍(lán)白斑篩選原理，每份標(biāo)本隨機(jī)挑取30個(gè)白斑，用plasmid mini kit進(jìn)行質(zhì)粒小提，由擎科生物公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.6基因序列分析使用Lasergene 7.1及BioEdit軟件對(duì)各片段進(jìn)行拼接校對(duì)及比對(duì)。從GenBank下載世界范圍內(nèi)具有代表性的HAV參考株全基因序列13條，我國VP1-2 A連接區(qū)分型序列3條。使用Mega7.0軟件，Neighbor-Joining法，Kimura-2-parameter模型，Bootstrap值1 000，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。使用RDP4軟件進(jìn)行重組分析， Simplot軟件驗(yàn)證結(jié)果。使用HyPhy軟件包(http://www.datamonkey.com)，SLAC法選擇最佳核苷酸替換模型，計(jì)算dN/dS值，dN和dS分別代表非同義替換率和同義替換率，其中dN/dS>1、dN/dS<1和dN/dS=1分別表明序列處于正向、負(fù)向及中性選擇[6]。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，克隆序列中標(biāo)本內(nèi)和標(biāo)本間基因進(jìn)化距離的比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[7]。

核苷酸變異數(shù)為各流行株所有克隆序列中與一致序列不同的核苷酸數(shù)目，氨基酸變異數(shù)為各流行株所有克隆序列中發(fā)生非同義替換的氨基酸數(shù)目。香農(nóng)熵值用來反映準(zhǔn)種變異特征，其計(jì)算公式為：SN/SNA=- [∑i (pi × ln pi)] / ln N，pi為每種獨(dú)特序列(核苷酸或氨基酸序列)在病毒群體中出現(xiàn)的頻率，N為克隆序列總數(shù)，香農(nóng)熵從0(最小多樣性)到1(最大多樣性)。

2 結(jié)果

2.1VP1-2A連接區(qū)基因分型及三株流行株序列間同源性分析VP1-2 A連接區(qū)(321 bp)系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，3株流行株核苷酸、氨基酸序列同源性均為100%，均屬于IA亞型，如圖1所示。與GenBank中最近的是廣西GgGx4.06株，同源性為99.4%；其次是日本AH2株，同源性為99.1%。

3株流行株間全基因組核苷酸同源性為99.9%～100%，存在2～7個(gè)核苷酸差異，位于5′端非編碼區(qū)及非結(jié)構(gòu)蛋白2C、3 A和3D區(qū)；全編碼區(qū)氨基酸同源性為100%。

表1 3株流行株在部分VP1區(qū)和VP1-2 A連接區(qū)準(zhǔn)種變異特征Tab.1 Characteristics of quasispecies spectrum in partial VP1 and VP1-2 A region of three strains

2.23株流行株全基因組序列與GenBank中HAV參考株間同源性分析基于全基因組構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，3株流行株均屬于IA亞型，與GenBank中選定的IA亞型參考株全基因組核苷酸同源性為96.0%～98.5%，其中與AH2株親緣關(guān)系最近，同源性為98.5%，全編碼區(qū)氨基酸同源性為99.0%～99.7%。與選定的其他型別參考株全基因組核苷酸同源性為79.0%～90.7%，全編碼區(qū)氨基酸同源性為93.1%～98.7%，如圖2所示。

2.3抗原中和位點(diǎn)分析文獻(xiàn)[8]中報(bào)道的抗原中和位點(diǎn)如VP3：Pro65、Asp70、Ser71、Gln74，VP1：Ser102、Asn104、Lys105、Ser114、Val166、Trp170、Val171、Ala176、Lys221、Gln232，以及基于結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)的表位VP2：Thr71和Ala198[9]。本研究中3株流行株序列在已發(fā)表的抗原中和位點(diǎn)處未發(fā)生氨基酸變異。

2.4重組及選擇壓力分析分別針對(duì)不同基因片段構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，流行株與參考株親緣關(guān)系結(jié)果并不一致，例如基于5′-UTR區(qū)建樹，雖然流行株與AH2株在同一分支，但進(jìn)化距離明顯更遠(yuǎn)，如圖3所示；基于2B區(qū)建樹，流行株與MNA12-130株親緣關(guān)系更近；而基于3C區(qū)建樹，AH2株與MNA12-130株自成一支(圖省略)。但通過RDP4和Simplot分析未發(fā)現(xiàn)明顯的亞型內(nèi)重組事件。3株流行株選擇壓力分析，全編碼區(qū)與結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)平均dN/dS值分別為0.028和0.015，均未發(fā)現(xiàn)正選擇位點(diǎn)。

2.5準(zhǔn)種特征分析3株流行株序列全長VP1-2 A區(qū)克隆測(cè)序，共得到78條有效序列(各株為26條序列)。使用所有克隆序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，序列間呈現(xiàn)無規(guī)律的散狀分布，如圖4所示。每株流行株內(nèi)的克隆序列，核苷酸和氨基酸同源性分別為99.0%～100%和98.1%～100%；在所有流行株中克隆獲得的序列之間，核苷酸和氨基酸同源性分別為99.0%～100%和97.2%～100%?？寺⌒蛄兄袠?biāo)本內(nèi)的平均基因進(jìn)化距離為0.0034，標(biāo)本間的平均基因進(jìn)化距離為0.0035，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.10)。將序列分為部分VP1區(qū)(nt 2208～2897)和VP1-2 A連接區(qū)(nt 2898～3286)，比較3株流行株各自的核苷酸和氨基酸變異率，VP1-2 A連接區(qū)均高于部分VP1區(qū)，如表1所示。

“●”表示本研究中的流行株圖1 VP1-2 A連接區(qū)核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化分析“●”indicates HAV isolates in this studyFig.1 Phylogenetic analysis based on VP1-2 A junction region

“●”表示本研究中的流行株圖2 基于全基因組構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹“●”indicates HAV isolates in this studyFig.2 Phylogenetic analysis based on whole-genome region

“●”表示本研究中的流行株圖3 基于5′-UTR區(qū)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹“●”indicates HAV isolates in this studyFig.3 Phylogenetic analysis based on 5′-UTR region

圖4 3株流行株克隆VP1-2 A區(qū)序列系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of cloning sequences based on VP1-2 A region

3 討論

隨著我國城市化進(jìn)程的加速，衛(wèi)生環(huán)境的改善以及疫苗的廣泛使用，全國甲肝的年發(fā)病率已由1990年的52.6/10萬，降至2012年的1.82/10萬[10]。然而，每年小規(guī)模的甲肝散發(fā)或暴發(fā)事件在各省市仍時(shí)有發(fā)生，給當(dāng)?shù)毓残l(wèi)生和疾病防控工作帶來挑戰(zhàn)。通過HAV分子流行病學(xué)研究，將基因分型與現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查相結(jié)合，利于甲肝病毒的溯源調(diào)查[11]。在所有基因片段中，VP1-2 A連接區(qū)常用于基因分型[12]，已成功對(duì)多起HAV食源性或水源性暴發(fā)事件進(jìn)行了基因分型和傳播溯源[13-15]。

本研究的3份甲肝患者血清標(biāo)本，在VP1-2 A連接區(qū)核苷酸同源性100%，均屬于IA亞型。病毒全長序列的核苷酸和氨基酸同源性分別為99.9%-100%和100%，即核苷酸差異為0.0%～0.1%。有文獻(xiàn)報(bào)道[16]，在VP1-2 A分型片段完全一致的HAV序列中，同源暴發(fā)序列其全基因組核苷酸差異可達(dá)到0.31%，而非同源暴發(fā)相關(guān)的序列則更高，可達(dá)到0.42%～0.88%。據(jù)此推測(cè)本實(shí)驗(yàn)3株流行株可能來自同一起感染事件。因此獲得HAV全基因組序列，結(jié)合現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查，能夠?qū)ν幢┌l(fā)事件進(jìn)行精確溯源。

同一年份同一地區(qū)的流行株可分屬于不同分支，如Bj5.07和Bj46.07處于兩個(gè)不同的分支；不同年份不同地區(qū)的流行株可分布于同一分支，如LU38與BbGx3.06具有完全一致的序列，提示我國甲肝流行的復(fù)雜性。HAV只有一個(gè)血清型，其抗原中和位點(diǎn)主要分布在結(jié)構(gòu)蛋白VP3和VP1編碼區(qū)，近年發(fā)現(xiàn)VP2編碼區(qū)的第71位、第198位氨基酸也為抗原中和位點(diǎn)[9]。本研究3株流行株序列在已發(fā)表的抗原中和位點(diǎn)處均未發(fā)生氨基酸變異。監(jiān)測(cè)流行株的抗原中和位點(diǎn)氨基酸變異情況，對(duì)甲肝疫苗的使用具有重要意義。本研究流行株中未檢測(cè)到重組現(xiàn)象，今后隨著GenBank中全序列的不斷增多，可進(jìn)一步驗(yàn)證。

全長VP1-2A區(qū)克隆測(cè)序分析，各流行株的克隆序列間呈無規(guī)律的散狀分布。流行株內(nèi)克隆序列、所有克隆序列間核苷酸與氨基酸同源性均較高(分別為99.0%～100%、98.1%～100%和99.0%～100%、97.2%～100%)，且克隆序列中標(biāo)本內(nèi)和標(biāo)本間的平均基因進(jìn)化距離差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明流行株間親緣關(guān)系比較近。流行株在VP1-2A連接區(qū)的核苷酸和氨基酸變異率均高于部分VP1區(qū)，因而VP1-2A連接區(qū)被廣泛應(yīng)用于基因分型。本研究觀察到KH8.14在3株流行株中核苷酸和氨基酸變異率、香農(nóng)熵均最低，這可能是由于病毒在宿主體內(nèi)經(jīng)受的免疫壓力不同，或標(biāo)本收集時(shí)間不同所致。此外，克隆測(cè)序方法選擇的準(zhǔn)種數(shù)量有限也可能產(chǎn)生影響。今后應(yīng)用新一代測(cè)序技術(shù)等手段，可增加測(cè)序廣度和深度，通過分析基因組不同區(qū)段的準(zhǔn)種特性或不同感染來源的流行株準(zhǔn)種特點(diǎn)，結(jié)合現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查，為甲肝溯源和分子流行病學(xué)分析提供更為詳盡的信息。

利益沖突:無

參考文獻(xiàn)

[1] Vaughan G, Goncalves Rossi LM, Forbi JC, et al. Hepatitis A virus: host interactions, molecular epidemiology and evolution [J]. Infect Genet Evol, 2014, 21(1): 227-243. DOI: 10.1016/j.meegid.2013.10.023.

[2] Cao J, Bi S, Meng Q,et al. Genotyping of acute hepatitis a virus isolatesfrom China, 2003-2008 [J]. J Med Virol, 2011, 83(7): 1134-1141. DOI: 10.1002/jmv.22086.

[3] Nainan OV, Xia G, Vaughan G, et al. Diagnosis of hepatitis a virus infection: a molecular approach [J]. Clin Microbiol Rev, 2006, 19(1): 63-79. DOI: 10.1128/CMR.19.1.63-79.2006.

[4] Sánchez G, Bosch A, Gómez-Mariano G, et al. Evidence for quasispecies distributions in the human hepatitis A virus genome [J]. Virology, 2003, 315(1): 34-42. DOI: 10.1016/s0042-6822(03)00483-5.

[5] 王昊. 我國甲肝病毒流行株全基因組序列分析及準(zhǔn)種變異研究 [D]. 中國疾病預(yù)防控制中心, 2014.

[6] 王昊, 曹經(jīng)瑗, 畢勝利. 我國甲型肝炎病毒BJ73株全基因組測(cè)定與分析 [J]. 中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志, 2014, 28(2): 105-107. DOI: 10. 3760/cma. j. issn. 1003-9279. 2014. 02. 010.

[7] 趙琦, 時(shí)麗麗, 蔣巖, 等. Miseq高通量測(cè)序平臺(tái)用于一起疑似經(jīng)性傳播HIV的溯源調(diào)查 [J]. 中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 48(6): 471-475. DOI: 10. 3760/cma. j. issn. 0253-9624. 2014. 06. 010.

[8] Pérez-Sautu U,Costafreda MI, Caylà J,et al.Hepatitis A virus vaccine escape variants and potential new serotype emergence [J]. Emerg Infect Dis, 2011, 17(4): 734-737. DOI: 10.3201/eid1704.10.1169.

[9] Wang X, Ren J, Gao Q, et al. Hepatitis A virus and the origins of picornaviruses [J]. Nature, 2015, 517(7532): 85-88. DOI: 10.1038/nature13806.

[10] Xu ZY, Wang XY. Live attenuated hepatitis A vaccines developed in China [J]. Hum Vaccin Immunother, 2014, 10(3): 659-666. DOI: 10.4161/hv.27124.

[11] Nainan OV, Armstrong GL, Han XH, et al. Hepatitis a molecular epidemiology in the United States, 1996-1997: Sources of infection and implications of vaccination policy [J]. J Infec Dis, 2005, 191(6): 957-963. DOI: 10.1086/427992.

[12] Yilmaz H, Karakullukcu A, Turan N, et al. Genotypes of hepatitis a virus in Turkey: first report and clinical profile of children infected with sub-genotypes IA and IIIA [J]. BMC Infect Dis, 2017, 17(1): 561. DOI: 10.1186/s12879-017-2667-3.

[13] Collier MG, Khudyakov YE, Selvage D, et al. Outbreak of hepatitis A in the USA associated with frozen pomegranate arils imported from Turkey: an epidemiological case study[J]. Lancet Infect Dis, 2014,14(10):976-981. DOI: 10.1016/S1473-3099(14)70883-7.

[14] Severi E, Verhoef L, Thornton L, et al. Large and prolonged food-borne multistate hepatitis A outbreak in Europe associated with consumption of frozen berries, 2013 to 2014 [J]. Euro Surveill, 2015, 20(29): 21192. PMID: 26227370.

[15] Bruni R, Taffon S, Equestre M, et al. Key role of sequencing to trace hepatitis A viruses circulating in Italy during a large multi-country European foodborne outbreak in 2013 [J]. PLoS One, 2016, 11(2): e0149642. DOI: 10.1371/journal.pone.0149642.

[16] Vaughan G, Xia G, Forbi JC, et al. Genetic relatedness among hepatitis A virus strains associated with food-borne outbreaks [J]. PLoS One, 2013, 8(11): e74546. DOI: 10.1371/journal.pone.0074546.