孫穎 白天 李梓 阮菲兒 陳玲玲 魯健 劉麗琦 王大燕 舒躍龍 秦堃

周劍芳

100052 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所 中國國家流感中心

流感是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，除了引發(fā)季節(jié)性流感的H1N1、H3N2和B型流感病毒之外，一些新型禽流感病毒(包括H5N1、H5N6、H6N2、H9N2、H7N9和H10N8等)可由禽感染人類，對(duì)人類健康造成了巨大威脅[1-3]，因此，尋找有效的流感治療措施十分重要。

血凝素(Hemagglutinin，HA)是流感病毒表面重要的糖蛋白，近年來，研究者發(fā)現(xiàn)大量可以對(duì)不同的流感病毒產(chǎn)生交叉保護(hù)作用的抗HA廣譜中和抗體[4-12]可有效應(yīng)對(duì)由HA抗原的高度變異所導(dǎo)致的免疫逃逸，對(duì)流感的防治具有重大意義。本研究通過對(duì)H5N1患者外周血中循環(huán)的B細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)及篩選獲得可表達(dá)流感抗體的B細(xì)胞，對(duì)其抗體基因庫進(jìn)行擴(kuò)增篩選，得到了由VH1-2編碼的抗HA廣譜反應(yīng)性抗體基因序列，并對(duì)其編碼抗體的功能進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1材料293T細(xì)胞及MDCK細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。飼養(yǎng)細(xì)胞為表面表達(dá)人CD40 L的3T3細(xì)胞，經(jīng)Co60照射，液氮保存。實(shí)驗(yàn)所用毒株A/Shanghai/1/2009(2009pdmH1N1, SH-H1N1), RG A/Hubei/1/2011(H5N1, HB-H5N1), RG A/Guangdong/1/2014(H5N6, GD-H5N6), A/waste water/Guangxi/2/2010(H6N2, GX-H6N2), A/HongKong/2009(H9N2,HK-H9N2), A/environment/Jiangxiboyanglake/1102/2014(H12N5, JX-H12N5), A/Hong Kong/01/1968(H3N2, HK-H3N2), RG A/Anhui/1/2016(H7N9, AH-H7N9) 和RG A/Jiangxi/346/2013(H10N8, JX-H10N8)。質(zhì)粒pVRC-GX/H5N1-HA、pVRC-GX/H5N1-NA、pVRC-GD003/H7N9-HA、 pVRC-AH/H7N9-NA的基因分別來源于A/Guangxi/1/2008(H5N1)、A/Anhui/1/2016(H7N9)、A/Guangdong/17SF003/2016(H7N9)，質(zhì)粒pNL4-3.luc為本室保存。重組HA蛋白HB-H5(A/Hubei/1/2011)和ZJ-H7(A/Zhejiang/1/2013)，由本室使用昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)純化。

1.2間接ELISA實(shí)驗(yàn)以HB-H5或ZJ-H7蛋白1 μg/ml，50 μl/孔包被96孔酶標(biāo)板，4 ℃過夜；1%BSA封閉1 h后使用PBST洗滌；待檢抗體從80 μg/ml開始做二倍稀釋，50 μl稀釋后的抗體或培養(yǎng)上清原液加入洗滌后的酶標(biāo)板中，37 ℃孵育1 h；充分洗滌之后加入1∶10000稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗人IgG(中杉金橋),37 ℃孵育1 h；充分洗滌，使用100 μl TMB顯色，50 μl 2 mmol/L H2SO4終止后讀取450 nm/630 nm處光吸收值。取空白對(duì)照10倍以上為陽性。

1.3假病毒(pps)制備及假病毒中和試驗(yàn)(ppsNT) 將對(duì)應(yīng)的HA、NA表達(dá)質(zhì)粒與pNL4-3.luc共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，制備GX-H5N1和GD003-H7N9假病毒。轉(zhuǎn)染后48 h收集轉(zhuǎn)染上清，1 350×g離心10 min去除沉淀，用0.22 μm針頭濾器(Millipore)抽濾后保存于4 ℃?zhèn)溆?。將MDCK細(xì)胞按3×104個(gè)/100 μl接種96孔板，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)過夜。待檢抗體從80 μg/ml開始做二倍稀釋，50 μl稀釋后的抗體或培養(yǎng)上清原液與50 μl假病毒混合，37 ℃相互作用1 h。使用PBS洗板1次，將抗體和假病毒混合液感染MDCK細(xì)胞,37 ℃，12 h后換含2% FBS MEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h,用報(bào)告基因檢測試劑盒(PerkinElmer)檢測相對(duì)熒光單位(RLU)。平行設(shè)置假病毒對(duì)照和細(xì)胞對(duì)照。中和百分率(%)=(假病毒對(duì)照RLU-檢測血清RLU)/(假病毒對(duì)照RLU-細(xì)胞對(duì)照RLU)×100%。取中和百分率>80%為陽性。

1.4B細(xì)胞培養(yǎng)、篩選及基因庫構(gòu)建、篩選本實(shí)驗(yàn)所使用外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)標(biāo)本于2009年分離自一位H5N1患者感染后20 d的外周血，凍存于液氮中。利用人記憶性B細(xì)胞分選試劑盒(STEMCELL)從復(fù)蘇的PBMC中分離出CD19+ B細(xì)胞，將大約20個(gè)B細(xì)胞與2×104個(gè)飼養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)在96孔板中，加入20 ng/ml hIL-2，1 μg/ml CpG2006和10 ng/ml hIL-21。培養(yǎng)10 d后篩選培養(yǎng)上清對(duì)HB-H5和ZJ-H7的結(jié)合。HB-H5結(jié)合陽性孔進(jìn)一步用GX-H5N1假病毒檢測。然后構(gòu)建抗體輕鏈和重鏈基因庫，方法參照Tiller等研究者[13]，每孔對(duì)10個(gè)以上重鏈或輕鏈克隆進(jìn)行測序，通過IMGT網(wǎng)站比對(duì)。將同孔的輕鏈、重鏈質(zhì)粒組合，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞；培養(yǎng)48 h后，測定上清對(duì)HB-H5和ZJ-H7的結(jié)合活性，及GX-H5N1假病毒中和活性。

1.5抗體體外表達(dá)及純化將6×106個(gè)293T細(xì)胞接種于T75中，37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)過夜；取輕、重鏈質(zhì)粒各10 μg共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)5 d，期間補(bǔ)加含 10% 低IgG FBS的DMEM培養(yǎng)基；收集轉(zhuǎn)染后的培養(yǎng)上清，865×g離心10 min，用0.45 μm濾器過濾；利用蠕動(dòng)泵，濾液以1.5 ml/min的速度流過蛋白G純化柱，捕獲IgG；利用AKTA儀器，用pH為2.7的甘氨酸-鹽酸洗脫液洗脫，收集純化的抗體?？贵w經(jīng)濃縮，緩沖液置換，分裝保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6抗體功能測定首先測定抗體的結(jié)合活性，假病毒中和活性。然后通過流式熒光細(xì)胞分選技術(shù)(FACS)檢測廣譜結(jié)合活性： 即用多種亞型流感病毒分別感染MDCK細(xì)胞，感染后12～14 h收集細(xì)胞；取106個(gè)感染細(xì)胞與終濃度為5 μg/ml的抗體混合，37 ℃孵育1 h；PBS清洗后加入1∶250稀釋的FITC標(biāo)記山羊抗人IgG，37 ℃孵育1 h；PBS清洗后上機(jī)檢測，使用BD Diva軟件分析。病毒感染用細(xì)胞內(nèi)NP蛋白染色確認(rèn)。

2 結(jié)果

2.1H5N1患者外周血B細(xì)胞篩選結(jié)果分選到5.8×104個(gè)B細(xì)胞，分2928孔進(jìn)行培養(yǎng)。用HB-H5 對(duì)培養(yǎng)10 d的上清篩選，篩選到38孔(1.3%)H5陽性克隆。進(jìn)一步篩選后有7孔H5/H7雙陽性細(xì)胞，約占0.24%，表明此H5N1感染患者外周血中已存在少量交叉反應(yīng)性B細(xì)胞。

2.2篩選獲得由VH1-2基因編碼的中和抗體綜合各個(gè)孔上清篩選結(jié)果，共挑選14孔B細(xì)胞進(jìn)行抗體基因文庫的構(gòu)建。初篩結(jié)果顯示3-32G7克隆孔為H5/H7雙陽性，該孔擴(kuò)增獲得一種重鏈，兩種輕鏈。其基因信息如表1所示。初篩結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VH1-2重鏈與這兩種輕鏈組合表達(dá)的抗體具有相似的抗原識(shí)別譜和對(duì)H5N1 pps的中和功能(表2)。

表1 3-32G7克隆孔抗體基因信息

注：“-”表示沒有此片段

Note: “-” indicates without this segment

表2 VH1-2編碼抗體功能

注：“+”表示抗體具有中和能力

Note: “+” indicates the Abs with neutralizing activity

2.3體外實(shí)驗(yàn)證明VH1-2編碼抗體可中和H5N1假病毒以輕鏈3-32G7-1與重鏈組合進(jìn)行體外大量表達(dá)并純化獲得單抗Ab3-32G7.1。Ab3-32G7.1對(duì)HB-H5和ZJ-H7的最低檢測濃度為1.87 μg/ml和6.20 μg/ml(圖1，以空白對(duì)照的10倍為最低檢測線)。相較于陰性對(duì)照Ab2-11E5(來源于本課題)，Ab3-32G7.1可有效地阻斷GX-H5N1假病毒對(duì)MDCK的感染,最低有效濃度為2.20 μg/ml，但對(duì)GD003-H7N9假病毒無中和作用(圖2)。

圖1 抗體Ab3-32G7.1對(duì)HB-H5和ZJ-H7的結(jié)合能力Fig.1 Binding capacity of Ab3-32G7.1 to HB-H5 and ZJ-H7

圖2 Ab3-32G7.1對(duì)GX-H5N1和GD003-H7N9假病毒的中和試驗(yàn)Fig.2 Neutralization test of Ab3-32G7.1 against GX-H5N1 and GD003-H7N9 PPS

2.4Ab3-32G7.1具有一定的廣譜結(jié)合活性我們使用流式細(xì)胞術(shù)測定Ab3-32G7.1對(duì)自然表達(dá)在被感染細(xì)胞表面的不同亞型HA的結(jié)合能力，發(fā)現(xiàn)其可以廣譜結(jié)合來自于Group1的H1，H5，H6以及H9亞型毒株的HA，但無法結(jié)合Group2的HA(圖3)。

圖3 Ab3-32G7.1對(duì)不同亞型HA的結(jié)合Fig.3 Binding of Ab3-32G7.1 to group 1HAS

3 討論

體液免疫在抵抗病毒性感染疾病中起到重要作用。研究發(fā)現(xiàn)抗流感的廣譜中和抗體常由機(jī)體記憶性B細(xì)胞或漿母細(xì)胞產(chǎn)生，且由某些特定的基因編碼，以VH1-69和VH3-30最為常見，如CR6261，F(xiàn)10，CR9114，27F3，F(xiàn)I6等等[5-9,11]。但同時(shí)，也存在由出現(xiàn)頻率較低的VH基因所編碼的高質(zhì)量抗體，如由VH6-1編碼的MEDI8852[10]，這幫助我們更全面的認(rèn)識(shí)抗流感病毒免疫的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。本研究中，我們篩選到由低頻率基因VH1-2所編碼的交叉反應(yīng)性抗體，該抗體可有效結(jié)合多種亞型流感病毒的HA，并具有H5N1中和活性。

由VH1-2編碼的抗體在HIV-1病毒和流感病毒感染中均有報(bào)道[12,14]。Whittle, J. R.等研究人員從疫苗接種者體內(nèi)篩選到由VH1-2編碼的廣譜中和抗體：CH65[12]。該抗體靶向HA頭部，可以廣譜結(jié)合H1亞型的不同毒株，其重鏈基因由VH1-2/DH1-1/JH6組成。相較而言，本研究發(fā)現(xiàn)的Ab3-32G7.1由不同的重排方式發(fā)育而來，可結(jié)合H1，H5，H6，H9及H7亞型。在3-32G7這一克隆孔中，同時(shí)存在兩種不同的輕鏈，均可與VH1-2編碼的這一重鏈組合產(chǎn)生功能相似的抗體。因此H5N1病毒感染可快速誘導(dǎo)體內(nèi)交叉反應(yīng)性B細(xì)胞循環(huán)到外周血，從而發(fā)揮效應(yīng)。

流式結(jié)果表明，Ab3-32G7.1可廣譜結(jié)合多種亞型HA，包括H1，H5，H6和H9。然而，ELISA結(jié)果顯示該抗體也可以結(jié)合H7亞型?？紤]兩種實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異，我們推斷可能因?yàn)槠渥R(shí)別HA的表位不同。在本研究中，流式分析所用的HA構(gòu)象處于HA0狀態(tài)，而ELISA實(shí)驗(yàn)所使用HA固定于酶標(biāo)板底部，由于其結(jié)合板底的方位不同可能呈現(xiàn)出不同的表位。這就有可能造成檢測結(jié)果的差異。本課題后續(xù)研究將探索Ab3-32G7.1所靶向的HA表位，及其在不同亞型毒株之間識(shí)別構(gòu)象的差別。Ab3-32G7.1僅對(duì)H5亞型病毒具有中和能力可能同其體突變程度相關(guān)，具體機(jī)制待研究。

本研究從H5N1感染患者發(fā)病20 d的外周血中分離到交叉反應(yīng)性抗體基因并對(duì)其功能進(jìn)行了初步測定。這有助于我們更加深入的了解流感病毒自然感染狀態(tài)下抗體應(yīng)答的遺傳學(xué)特征，以及抗HA廣譜抗體的特性，為有效防治流感提供理論基礎(chǔ)。

利益沖突:無

參考文獻(xiàn)

[1] Bui CM, Chughtai AA, Adam DC, et al. An overview of the epidemiology and emergence of influenza A infection in humans over time[J]. Arch Public Health, 2017, 75: 15. DOI: 10.1186/s13690-017-0182-z.

[2] 郭元吉. 高致病性禽流感研究進(jìn)展[J]. 中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志, 2006, 20(2): 90-93. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2006.02.030.

[3] 張燁, 舒躍龍. 2004-2012年我國禽流感流行情況[J]. 中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志, 2013, 27(3): 239-240. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2013.03.027.

[4] Skehel JJ, Wiley DC. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin[J]. Annu Rev Biochem, 2000, 69: 531-569. DOI: 10.1146/annurev.biochem.69.1.531.

[5] Throsby M, van den Brink E, Jongeneelen M, et al. Heterosubtypic neutralizing monoclonal antibodies cross-protective against H5N1 and H1N1 recovered from human IgM+ memory B cells[J]. PLoS One, 2008, 3(12): e3942. DOI: 10.1371/journal.pone.0003942.

[6] Sui J, Hwang WC, Perez S, et al. Structural and functional bases for broad-spectrum neutralization of avian and human influenza A viruses[J]. Nat Struct Mol Biol, 2009, 16(3): 265-273.DOI: 10.1038/nsmb.1566.

[7] Corti D, Voss J, Gamblin SJ, et al. A neutralizing antibody selected from plasma cells that binds to group 1 and group 2 influenza A hemagglutinins[J]. Science, 2011, 333(6044): 850-856.DOI: 10.1126/science.1205669.

[8] Dreyfus C, Laursen NS, Kwaks T, et al. Highly conserved protective epitopes on influenza B viruses[J]. Science, 2012, 337(6100): 1343-1348. DOI: 10.1126/science.1222908.

[9] Fu Y, Zhang Z, Sheehan J, et al. A broadly neutralizing anti-influenza antibody reveals ongoing capacity of haemagglutinin-specific memory B cells to evolve[J]. Nat Commun, 2016, 7: 12780. DOI: 10.1038/ncomms12780.

[10] Kallewaard NL, Corti D, Collins PJ, et al. Structure and Function Analysis of an Antibody Recognizing All Influenza A Subtypes[J]. Cell, 2016, 166(3): 596-608.DOI: 10.1016/j.cell.2016.05.073.

[11] Lang S, Xie J, Zhu X, et al. Antibody 27F3 Broadly Targets Influenza A Group 1 and 2 Hemagglutinins through a Further Variation in VH1-69 Antibody Orientation on the HA Stem[J]. Cell Rep, 2017, 20(12): 2935-2943. DOI: 10.1016/j.celrep.2017.08.084.

[12] Whittle JR, Zhang R, Khurana S, et al. Broadly neutralizing human antibody that recognizes the receptor-binding pocket of influenza virus hemagglutinin[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108(34): 14216-14221. DOI: 10.1073/pnas.1111497108.

[13] Tiller T. Single B cell antibody technologies[J]. N Biotechnol, 2011, 28(5): 453-457.DOI: 10.1016/j.nbt.2011.03.014.

[14] Navis M, Tran K, Bale S, et al. HIV-1 receptor binding site-directed antibodies using a VH1-2 gene segment orthologue are activated by Env trimer immunization[J]. PLoS Pathog, 2014, 10(8): e1004337. DOI: 10.1371/journal.ppat.1004337.