周亮 張建勇 張泓 陳玲 王莉

563003 遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸二科

甲型流感病毒傳染性強(qiáng)，人群感染率高，哮喘患者對(duì)流感病毒易感性增強(qiáng)[1]，流感病毒的易感性受到宿主細(xì)胞唾液酸受體表達(dá)的影響。哮喘患者急性發(fā)作時(shí)常使用糖皮質(zhì)激素吸入來(lái)治療，關(guān)于哮喘后機(jī)體氣道上皮細(xì)胞唾液酸受體表達(dá)的變化及糖皮質(zhì)激素干預(yù)對(duì)其的影響，目前尚不清楚。本研究擬通過(guò)構(gòu)建哮喘小鼠模型，觀察甲型流感病毒唾液酸受體在哮喘小鼠氣道組織中的表達(dá)及地塞米松干預(yù)對(duì)該受體表達(dá)的影響，探討哮喘合并流感病毒感染的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料清潔級(jí)雌性BALB/c小鼠30只，5～6周齡，體重(20±2)g，購(gòu)于中科院上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證號(hào)：SCXK(滬)2007-0005)；V級(jí)卵清白蛋白 (OVA，美國(guó)Sigma公司,貨號(hào)A5503，批號(hào)031M7 008 V)，氫氧化鋁凝膠(美國(guó)Invivogen公司,貨號(hào)vac-alu-250,批號(hào)AHG-34-690),小鼠IL-5 ELISA試劑盒(美國(guó)R&D公司,貨號(hào)PM5000,批號(hào)201303),小鼠抗Mucin 5AC單克隆抗體(美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司,MA5-12178,批號(hào)NA1 499 464 A), 山槐凝集素粉I (MAA-I,貨號(hào)B-1315,批號(hào)V0310)、山槐凝集素粉II (MAA-II,貨號(hào)B1265,批號(hào)X0424)、黑接骨木凝集素(SNA,貨號(hào)B-1305,批號(hào)V0225) 及熒光素Fluorescent Avidin DCS(貨號(hào)A-2011,批號(hào)V1112) 均購(gòu)自美國(guó)VECTOR Laboratories公司，DAPI購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司，AB-PAS染色試劑盒購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司,熒光顯微鏡DMIL LED、Leica Application Suite V4采圖系統(tǒng)均購(gòu)自德國(guó)Leica公司。

1.2小鼠哮喘模型的構(gòu)建與分組采用隨機(jī)數(shù)字法將30只BALB/c小鼠分為正常組(N組)、哮喘組(A組)、地塞米松干預(yù)組(D組)，每組各10只。建立小鼠哮喘模型：A組于第1、13天腹腔注射致敏液0.2 ml(含OVA 20 μg和氫氧化鋁凝膠0.1 mg)，第19天霧化吸入10%OVA溶液激發(fā)，1次/d，30 min/次，連續(xù)5 d；D組于每 d霧化吸入前30 min予地塞米松2 mg/kg腹腔注射，1次/d，余處理同A組。

1.3支氣管肺泡灌洗液(BALF)及肺組織切片的制備各組小鼠在末次霧化吸入后24 h, 用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后, 腹主動(dòng)脈放血致死。 切開(kāi)氣管并插管，采集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)，ELISA方法測(cè)定IL-5濃度；制備肺組織石蠟包埋切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色于光鏡下觀察及炎癥評(píng)分、阿爾新藍(lán)-過(guò)碘酸-雪夫(AB-PAS)染色觀察氣道黏液物質(zhì)。免疫組化法(IHC)檢測(cè)肺組織Muc5ac蛋白表達(dá)。

1.4免疫熒光組織染色標(biāo)本處理及采用免疫熒光法觀察小鼠氣道組織中唾液酸受體分布和表達(dá)的具體方法如文獻(xiàn)所述[9]。切片經(jīng)過(guò)脫蠟水化抗原修復(fù)后，分別用特異性抗體MAA-I(特異性結(jié)合SAa2,3galb1,4GlcNac)、MAA-II(特異性結(jié)合 SAa2,3galb1,3GlcNac)、SNA(特異性結(jié)合SAa2,6-gal)孵育，PBS作空白對(duì)照，室溫孵育2 h，沖洗后用熒光素標(biāo)記Fluorescent Avidin DCS(發(fā)綠色熒光)的二抗室溫孵育30 min，用DAPI溶液(10 μg/ml)標(biāo)記細(xì)胞核后封片。每組組織切片在鏡下隨機(jī)取10個(gè)氣道，分別采集其綠色和藍(lán)色熒光圖像，計(jì)數(shù)每個(gè)氣道上皮的細(xì)胞核數(shù)及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，并且計(jì)算各組氣道陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)比例及每種一抗的平均陽(yáng)性率。

2 結(jié)果

2.1哮喘小鼠模型的構(gòu)建本研究首先建立了小鼠哮喘模型，測(cè)定了與哮喘相關(guān)的細(xì)胞學(xué)、病理學(xué)和生物化學(xué)指標(biāo)。主要指標(biāo)包括BALF中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)與IL-5濃度、氣道炎癥評(píng)分和氣道黏液分泌狀況。肺組織切片HE染色的結(jié)果顯示N組支氣管管壁及肺泡壁結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)明顯杯狀細(xì)胞增生及黏液分泌(見(jiàn)圖1 A)；A組氣道及血管周圍可見(jiàn)以嗜酸性粒細(xì)胞為主的大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。支氣管黏膜上皮少量脫落，不完整，可見(jiàn)杯狀細(xì)胞增生，氣道黏液增多，管壁增厚，支氣管管腔變窄，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分高于N組及D組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000,P<0.01)(見(jiàn)圖1B和表2)。D組氣道及血管周圍見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，偶見(jiàn)嗜酸性粒細(xì)胞，無(wú)明顯杯狀細(xì)胞增生及黏液分泌 (見(jiàn)圖1C)；BALF中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞百分比及絕對(duì)值A(chǔ)組明顯高于N組及D組(P均=0.000<0.01)(詳見(jiàn)表1)。ELISA結(jié)果顯示，A組小鼠BALF中IL-5水平高于N組及D組(P=0.000<0.01)(詳見(jiàn)表1)。AB-PAS染色的結(jié)果顯示N組小鼠氣道上皮未見(jiàn)杯狀細(xì)胞，管腔內(nèi)未見(jiàn)黏液分泌(見(jiàn)圖1D)；A組小鼠氣道上皮可見(jiàn)大量增生杯狀細(xì)胞(染成紫紅色，見(jiàn)圖1E)，D組見(jiàn)少量杯狀細(xì)胞(圖1F)。A組氣道上皮杯狀細(xì)胞及黏液物質(zhì)陽(yáng)性相對(duì)著色面積較N組明顯增高(P=0.000<0.01)(詳見(jiàn)表2)。Muc5ac的IHC結(jié)果顯示Muc5ac蛋白陽(yáng)性表達(dá)主要在氣道上皮杯狀細(xì)胞及管腔內(nèi)，N組未見(jiàn)Muc5ac蛋白表達(dá)(圖1G)，A、D組可見(jiàn)Muc5ac蛋白表達(dá)(見(jiàn)圖1H,I)，且A組較N、D兩組明顯增加(P=0.000<0.01)(詳見(jiàn)表2)。以上結(jié)果表明我們構(gòu)建的哮喘小鼠模型具備哮喘的病理學(xué)改變特征，即哮喘組(A組)BALF嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)與IL-5濃度、氣道炎癥評(píng)分、氣道黏液分泌較正常組(N組)均升高(P=0.020<0.05)，而地塞米松干預(yù)組(D組)上述指標(biāo)較A組降低(P=0.060>0.05)(見(jiàn)表1，2；圖1)。

表1 3組小鼠BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)及IL-5的變化

注：與N組比較，##P<0.01；與A組比較，△△P<0.01.N, 正常組; A, 哮喘組; D,地塞米松干預(yù)組

Note: Compared with N group，##P<0.01；Compared with A group，△△P<0.01.N, Normal group; A, Asthma group; D, Dexamethasone intervention group

2.2唾液酸受體表達(dá)的定性分析為了觀察對(duì)比流感病毒唾液酸a2,3-半乳糖(SAa2,3-gal)和唾液酸a2,6-半乳糖(SAa2,6-gal)受體在模型鼠氣道組織中的分布和表達(dá)，以及地塞米松干預(yù)對(duì)其表達(dá)的影響, 本研究應(yīng)用特異性結(jié)合SAa2,3-gal的植物凝集素MAA-I、MAA-II，以及特異性結(jié)合SAa2,3-gal的植物凝集素SNA作為一抗，經(jīng)熒光素Fluorescent Avidin DCS標(biāo)記，運(yùn)用熒光顯微鏡觀察各組肺組織熒光信號(hào)。結(jié)果顯示，陽(yáng)性信號(hào)呈綠色熒光，位于細(xì)支氣管上皮面向管腔的頂端細(xì)胞膜及肺泡上皮細(xì)胞表面，DAPI染色的細(xì)胞核呈細(xì)顆粒狀，顯藍(lán)色熒光。SNA、MAA-II在3組氣道上皮均呈陽(yáng)性，SNA均為局灶性分布，MAA-II在N組呈局灶性分布，在A、D兩組呈連續(xù)性線性分布；MAA-I在N組未見(jiàn)表達(dá)，A組偶見(jiàn)表達(dá)，D組局灶性分布?？瞻讓?duì)照組未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)(見(jiàn)表3和圖2)。以上結(jié)果表明，流感病毒唾液酸SAa2,3-gal、SAa2,6-gal受體在正常組小鼠、哮喘組小鼠以及地塞米松干預(yù)組小鼠的氣道組織中均有表達(dá)。

2.3唾液酸受體表達(dá)的定量分析為了解流感病毒唾液酸SAa2,3-gal、SAa2,6-gal受體在各組表達(dá)量的差異，我們對(duì)各組唾液酸受體的表達(dá)進(jìn)行了定量分析。結(jié)果顯示A組中MAA-II的平均陽(yáng)性率高于N組，而且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000<0.01)。A組中SNA和MAA-I的平均陽(yáng)性率高于N組，但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.070>0.05)。3種凝集素(SNA、MAA-I、MAA-II)在D組的平均陽(yáng)性率均高于A組和N組(MAA-II，D組與A組比較，P=0.001<0.05，余組間比較P=0.000<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？瞻讓?duì)照組氣道上皮未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)(見(jiàn)表4)。以上研究結(jié)果表明，SAa2,3-gal在哮喘組的表達(dá)較正常組增強(qiáng)；而地塞米松干預(yù)組，SAa2,3-gal、SAa2,6-gal較正常組及哮喘組表達(dá)均增強(qiáng)。

2.4唾液酸受體表達(dá)的綜合分析綜上所述，結(jié)合定性分析及定量分析結(jié)果顯示，唾液酸受體陽(yáng)性表達(dá)位于細(xì)支氣管及肺泡上皮。SAa2,3-gal和SAa2,6-gal在各組均有表達(dá)。哮喘組氣道上皮細(xì)胞SAa2,3-gal較正常組升高，地塞米松干預(yù)組氣道上皮細(xì)胞SAa2,3-gal和SAa2,6-gal表達(dá)均較正常組和哮喘組升高(P=0.000<0.05)。

HE染色(20×)觀察正常組(A)、哮喘組(B)和地塞米松干預(yù)組(C)小鼠氣道組織炎癥改變；AB-PAS 染色(20×)觀察正常組(D)、哮喘組(E)和地塞米松干預(yù)組(F)小鼠氣道組織黏液分泌；IHC染色(20×)觀察正常組(G)、哮喘組(H)和地塞米松干預(yù)組(I)Muc5ac蛋白表達(dá)
圖1 哮喘小鼠模型構(gòu)建相關(guān)指標(biāo)觀察
HE staining (20×) observed changes in airway tissue inflammation in normal group (A), asthma group (B), and dexamethasone intervention group (C)；AB-PAS staining (20×) was used to observe mucus secretion in airway tissue of normal group (D), asthma group (E) and dexamethasone intervention group (F)；IHC staining (20×) observed Muc5ac protein expression in normal group (G), asthma group (H) and dexamethasone intervention group (I)
Fig.1 Observation of related indicators for asthma mouse model

注：與N組比較，##P<0.01；與A組比較，△△P<0.01.N, 正常組; A, 哮喘組; D,地塞米松干預(yù)組

Note: Compared with N group，##P<0.01；Compared with A group，△△P<0.01..N, Normal group; A, Asthma group; D,Dexamethasone intervention group

圖2 免疫熒光(20×)鏡下觀察3種凝集素在各組小鼠氣道上皮中的表達(dá)
Fig.2 Immunofluorescence (20×) observation of the expression of three lectins in airway epithelium of mice

表3甲型流感病毒唾液酸受體在各組小鼠氣道組織分布的定性分析

Tab.3Qualitative Analysis of Airway Tissue Distribution of Influenza A Virus Sialoid Receptor in Each Mouse Group

注：“-”表示陰性，“+”表示陽(yáng)性.N, 正常組; A, 哮喘組; D,地塞米松干預(yù)組

Note:“-”means negative；“+”means positive. N, Normal group; A, Asthma group; D, Dexamethasone intervention group

表4 3組小鼠氣道上皮陽(yáng)性細(xì)胞率的變化

Tab.4Change of airway epithelial cell positive rate in the three groups of mice

注：與N組比較，##P<0.01；與A組比較，☆P<0.05；△△P<0.01.N, 正常組; A, 哮喘組; D,地塞米松干預(yù)組

Note: Compared with N group，##P<0.01；Compared with A group，☆P<0.05;；△△P<0.01. N, Normal group; A, Asthma group; D, Dexamethasone intervention group

3 討論

氣道慢性炎癥是哮喘的本質(zhì)特征，嗜酸性粒細(xì)胞是參與氣道炎癥的重要炎性細(xì)胞，被認(rèn)為幾乎參與了哮喘發(fā)病機(jī)制的各個(gè)方面[2]，IL-5則是嗜酸性粒細(xì)胞強(qiáng)力趨化因子。本研究結(jié)果顯示，哮喘組BALF中細(xì)胞總數(shù)明顯高于正常對(duì)照組，且細(xì)胞分類計(jì)數(shù)表明以嗜酸性粒細(xì)胞為主，與氣道周圍大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)相符，ELISA結(jié)果顯示BALF中IL-5水平明顯增高，表明哮喘組小鼠出現(xiàn)典型的以嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主的氣道炎癥改變。氣道黏液高分泌是哮喘重要的病理生理特征之一，是哮喘發(fā)病和致死的高危因素[3]。氣道黏蛋白Muc5ac表達(dá)量是反映哮喘氣道黏液分泌強(qiáng)度的重要指標(biāo)。小鼠氣道組織AB-PAS染色結(jié)果提示，哮喘組氣道杯狀細(xì)胞增生和黏液物質(zhì)分泌均高于正常對(duì)照組，IHC觀察氣道組織Muc5ac蛋白表達(dá)也較正常組增高，提示哮喘小鼠存在以Muc5ac增高為標(biāo)志的氣道上皮杯狀細(xì)胞增生和黏液高分泌。因此，本研究成功構(gòu)建了以氣道慢性炎癥和氣道黏液高分泌為特征的哮喘小鼠模型。

呼吸道合胞病毒、鼻病毒等病毒所致呼吸道感染在誘發(fā)哮喘急性發(fā)作的作用已經(jīng)得到足夠的重視[4-5]，但流感病毒感染與哮喘發(fā)病的關(guān)系常被忽視。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，流感病毒感染與哮喘氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性及氣道重塑均有關(guān)[6]。Kloepfer等[1]對(duì)95名哮喘患兒和66名非哮喘兒童的觀察結(jié)果顯示，人鼻病毒等其他呼吸道病毒在哮喘與非哮喘組患者的感染率無(wú)明顯差異，而哮喘組流感病毒H1N1的感染率卻是非哮喘組的兩倍，其機(jī)制尚不清楚。研究表明，呼吸道上皮細(xì)胞表面的唾液酸受體(SAa2,3-gal、SAa2,6-gal)是甲型流感病毒侵入機(jī)體并進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)病毒增殖的重要門(mén)戶。禽和人流感病毒HA分別與SAa2,3-gal和SAa2,6-gal特異性結(jié)合，這種結(jié)合特性可能是流感病毒感染不同宿主的決定性因素[7-8]。因此，宿主呼吸道上皮細(xì)胞表面SAa2,3-gal和SAa2,6-gal的表達(dá)是流感病毒感染機(jī)體的關(guān)鍵。

免疫熒光技術(shù)是目前觀察流感病毒唾液酸受體表達(dá)的常用方法，兩種外源性植物凝集素SNA和MAA可以分別特異性結(jié)合SAa2,6-Gal和SAa2,3-Gal，其中MAA有兩種異構(gòu)體MAA-I和MAA-II。通過(guò)觀察陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，可以定性分析判斷受體的分布。Wang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，單純的定性分析存在一定局限性，而定量分析的方法正在受到更多研究者們的重視。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[10-12]，MAA-I廣泛結(jié)合在上、下呼吸道上皮細(xì)胞，MAA-II主要局限地結(jié)合于肺泡細(xì)胞上，由此反映a2,3唾液酸在呼吸道與肺組織的分布不同。本研究采用SNA、MAA-I、MAA-II 三種凝集素通過(guò)免疫熒光法分別觀察Sa2,6-gal、SAa2,3-gal在哮喘小鼠氣道組織的表達(dá)。本研究結(jié)果表明，定性分析發(fā)現(xiàn)SNA、MAA-II 在各組小鼠氣道均呈陽(yáng)性，提示正常組、哮喘組及地塞米松干預(yù)組小鼠氣道組織均有SAa2,6-gal和SAa2,3-gal表達(dá)；定量分析發(fā)現(xiàn)，SNA、MAA-I、MAA-II在各組小鼠氣道上皮均表達(dá)，正常組和哮喘組SNA、MAA-I陽(yáng)性率均無(wú)明顯差異，而哮喘組MAA-II陽(yáng)性率較正常對(duì)照組升高，提示正常組和哮喘組兩組間相應(yīng)的唾液酸受體SAa2,6-gal和SAa2,3-gal的表達(dá)水平并無(wú)不同，而哮喘組氣道上皮唾液酸受體SAa2,3-gal表達(dá)高于正常對(duì)照組。哮喘組與正常對(duì)照組MAA-I和MAA-II在反映SAa2,3-gal表達(dá)的不同，其可能是兩種MAA與SAa2,3-gal糖苷鍵結(jié)合有差異，MAA-I 特異性結(jié)合 SAa2,3Galb1,4GlcNac,MAA-II特異性結(jié)合SAa2,3Galb1,3GlcNac，MAA-I與SAa2,3Galb1,4GlcNac結(jié)合力較弱；與正常組相比，哮喘組SAa2,6-gal表達(dá)無(wú)明顯變化，但SA2a,3-gal表達(dá)增強(qiáng)。哮喘組氣道上皮杯狀細(xì)胞增生明顯，Zhang 等[13]研究表明流感病毒感染后杯狀細(xì)胞增生和SAa2,3-gal表達(dá)可能具有一定相關(guān)相關(guān)性。因此，我們推測(cè)，哮喘氣道上皮增生的杯狀細(xì)胞上流感病毒唾液酸受體SAa2,3-gal表達(dá)的增強(qiáng)，可能是導(dǎo)致機(jī)體對(duì)甲型流感病毒易感性增加的機(jī)制之一。

本研究定量分析結(jié)果顯示，3種凝集素在地塞米松干預(yù)組的陽(yáng)性細(xì)胞率均高于哮喘和正常對(duì)照組，提示地塞米松干預(yù)可上調(diào)哮喘小鼠氣道流感病毒唾液酸SAa2,3-gal和SAa2,6-gal兩種受體的表達(dá)，其結(jié)果可能促進(jìn)流感病毒在小鼠氣道上皮細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，最終導(dǎo)致機(jī)體排出流感病毒的時(shí)間延長(zhǎng)。由此推測(cè)，糖皮質(zhì)激素治療可能引起哮喘患者對(duì)流感的易感性增高。

Furuya 等[14]對(duì)宿主黏膜免疫功能方面的研究結(jié)果顯示，哮喘可使繼發(fā)的異源性流感病毒感染增加。此外，唾液酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)也可能是決定流感病毒的組織和宿主趨向性的重要因素[15]。因此，在今后的實(shí)驗(yàn)研究中我們可采用不同來(lái)源的流感病毒來(lái)感染正常、哮喘及地塞米松干預(yù)小鼠，并觀察不同流感病毒在正常、哮喘及地塞米松干預(yù)小鼠中的復(fù)制和致病性方面的差異，從而進(jìn)一步深入研究流感病毒唾液酸受體的分布和表達(dá)在哮喘致流感病毒易感性升高發(fā)生機(jī)制中的作用。

利益沖突無(wú)

參考文獻(xiàn)

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