王賢軍 劉云惠 孟飛 楊寧敏

310006 杭州市第一人民醫(yī)院檢驗科(王賢軍)；310030 杭州致遠醫(yī)學檢驗所有限公司(劉云惠、孟飛、楊寧敏)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)是一種逆轉(zhuǎn)錄DNA病毒，發(fā)現(xiàn)變異株混合體是HBV免疫預(yù)防的關(guān)鍵[1-2]。目前，傳統(tǒng)Sanger測序只能檢測到宿主體內(nèi)特定病毒株序列片段，對基因全長及大量的低頻突變檢測存在局限性，不能真實反映病毒在宿主體內(nèi)的情況[3]。高通量測序可以在一次測序中對數(shù)十萬到數(shù)百萬條的HBV序列進行深度測序[4-5]，可檢測出病毒低頻率突變。但由于血液中宿主核酸量大，干擾因素多，高通量測序前的文庫構(gòu)建成為HBV等病毒全基因組測序亟待解決的問題。尤其是針對低濃度的血液樣品，需要探索建立一種切實可行的建庫方式。本研究分別采用病毒核酸直接建庫及病毒擴增子建庫的方法，對高、中、低拷貝的HBV病毒血液進行高通量測序，從覆蓋度、深度及宿主內(nèi)單核苷酸變異分析(intra-host single nucleotide variations，iSNVs)對HBV基因組進行分析。

1 材料與方法

1.1病例選擇入選2016年3～12月杭州市第一人民醫(yī)院住院部收治的HBV感染患者18例為研究對象。本研究經(jīng)杭州市第一人民醫(yī)院倫理委員會批準。所有患者均簽署知情同意書。

1.2病毒基因組提取將18份血液分別分離血漿大于500 μl，使用干凈的EP管分裝后，4 ℃，10 000 xg離心15 min，收集上清200 μl。按照PureLinkTMViral RNA/DNA Mini Kit(美國，Thermo Fisher Scientific公司)要求提取HBV DNA。最后，用25 μl RNAase-free水洗脫DNA后置于-20 ℃保存。

1.3病毒濃度測定及高通量測序樣本選擇采用乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒(PCR熒光探針法)(中國，深圳市普瑞康生物技術(shù)有限公司)，以提取的病毒核酸為模板，對HBV病毒DNA樣本進行定量(拷貝/ml)。所有操作均按照試劑盒說明進行。根據(jù)HBV DNA定量的結(jié)果，選擇3個不同拷貝數(shù)樣品作為高通量測序?qū)ο螅篈.低拷貝數(shù)(2.67×103拷貝/ml)樣品；B.中等拷貝數(shù)(4.95×105拷貝/ml)樣品；C.高拷貝數(shù)(1.83×107拷貝/ml)樣品。

1.4巢式PCR擴增引物設(shè)計及HBV基因組擴增由生工生物工程(上海)股份有限公司合成巢式PCR擴增引物，以3個不同濃度HBV核酸為模板，以AR1(Forward)5′-ACAGTGGGGGAAAGC-3′，P3(Reverse)5′-CTCGCTCGCCCAAATTTTTCACCTCTGCCTAATCA-3′為第一段第一輪擴增引物；以AF1(Forward)5′-GTCTGCGGCGTTTTATC-3′，P4(Revers-e)5′-CTGGTTCGGCCCAAAAAGTTG CATGGTGCTGG3′為第二段第一輪擴增引物進行PCR擴增。待第一輪PCR擴增結(jié)束后，分別以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，以AR2(Forward)5′-AGA AACGGRCTGAGGC-3′，P3(Reverse)5′-CTCGCTCGCCCAAATTTTTCACCTCTGCCTAAT CA-3′為第一段第二輪擴增引物；以AF2(Forward)5′-TGCCCGTTTGTCCTCTA-3′，P4(Reverse)5′-CTGGTTCGGCCCAAAAAGTTGCATGGTGCTGG-3′為第二段第二輪擴增引物進行第二輪PCR擴增。巢式PCR擴增程序為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2.5 min，35(第一輪)/20(第二輪)個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。反應(yīng)均使用LA Taq聚合酶(5U/μl)PCR套裝(日本，TaKaRa公司)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行Sanger測序，驗證2段HBV基因片段正確性。

1.5文庫的制備和高通量測序病毒核酸直接建庫組：A、B、C三個不同濃度的核酸經(jīng)Qubit2.0定量后，直接按照Nextera XT DNA Library Preparation Kit試劑盒(美國，Illumina公司)說明進行文庫構(gòu)建。

病毒擴增子建庫組：巢式PCR擴增分別進行兩段第一輪PCR擴增，擴增產(chǎn)物分別使用磁珠純化，再進行第二輪PCR擴增后，磁珠純化且用Qubit2.0測定濃度，等摩爾混合，再次使用Qubit2.0定量，作為擴增子測序建庫DNA樣本。按照Nextera XT DNA Library Preparation Kit試劑盒(美國，Illumina公司)操作進行文庫構(gòu)建。兩組文庫構(gòu)建完后，再次用Qubit2.0測定濃度，使用Aligent2000(美國，Agilent Technologies公司)檢測待測序文庫的質(zhì)量。對混合樣本使用Illumina MiSeq測序平臺進行高通量測序。

注：X軸表示HBV基因組中的核苷酸位置，Y軸表示讀取的位點深度圖1 HBV參考基因組上的數(shù)據(jù)的覆蓋和位點深度Note: X-axis represents nucleotide position in the HBV genome; Y-axis represents the site-depth of reads.Fig.1 The coverage and site-depth of reads on HBV reference genome

1.6數(shù)據(jù)分析對FASTQ格式的原始數(shù)據(jù)進行過濾處理。為了降低突變的錯誤率，過濾掉起始的10個堿基，并截斷了每個> Q20讀數(shù)的末端30個堿基。使用Bowtie2軟件將其余的正確配對的數(shù)據(jù)與HBV B型參考基因組(GenBank序列號AB981583)進行匹配。使用映射算法中的默認參數(shù)調(diào)用iSNVs。

2 結(jié)果

2.1巢式PCR擴增結(jié)果經(jīng)過兩輪PCR后，第一段和第二段的產(chǎn)物分別為2 092 bp和1 320 bp。Sanger測序的結(jié)果表明，PCR產(chǎn)物的序列屬于HBV全基因組。由此可見，不同濃度的HBV樣品可以采用本研究中使用的巢式PCR擴增HBV全基因組。

2.2病毒核酸直接建庫對高通量測序的影響病毒核酸直接建庫組，經(jīng)過高通量測序后，獲得原始數(shù)據(jù)。過濾掉低質(zhì)量數(shù)據(jù)后，獲得平均177萬的數(shù)據(jù)用于下一步的生物信息學分析，其中樣品A有1.6 M數(shù)據(jù)，樣品B有1.7 M數(shù)據(jù)，樣品C有2.0 M數(shù)據(jù)。將數(shù)據(jù)中人類基因組數(shù)據(jù)剔除，剩余數(shù)據(jù)匹配到病毒數(shù)據(jù)庫。結(jié)果顯示，匹配到HBV基因組的數(shù)據(jù)量很低，在高拷貝數(shù)樣品C和中間拷貝數(shù)樣品B中僅分別匹配10個數(shù)據(jù)和4個數(shù)據(jù)，而低拷貝數(shù)樣品A沒有數(shù)據(jù)匹配到HBV基因組。這表明，病毒核酸直接建庫不能應(yīng)用到高通量測序中，尤其是病毒含量低的樣本，因人類基因組數(shù)據(jù)干擾過大，使得測序后有效數(shù)據(jù)量極少。

2.3巢式PCR擴增子建庫對高通量測序的影響巢式PCR擴增子建庫組，將高通量測序的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過過濾低質(zhì)量數(shù)據(jù)處理后，獲得每個樣品平均6 034個待分析數(shù)據(jù)，范圍從5 395至6 806。處理后的雙末端讀數(shù)與HBV基因組的參考序列比對，3個樣品匹配率都接近80%。而且每個樣品都具有相近的量級，說明本次高通量測序覆蓋程度和深度良好，見表1。根據(jù)3個樣品的測序覆蓋度和深度圖可以看出：HBV基因在nt1 823～nt1 841位置的測序深度不足，這是由于HBV基因組結(jié)構(gòu)在此位置存在缺口；測序結(jié)果在nt500～nt750的位置也具有較低的深度，這是因為該片段DNA在相鄰擴增子之間序列重疊造成，見圖1。這種兩組較低測序深度是不可避免的。因此，不同拷貝數(shù)的樣品通過巢式PCR擴增子建庫，經(jīng)過高通量測序，能夠獲得均勻性數(shù)據(jù)且數(shù)據(jù)偏差低。

表1 擴增子高通量測序結(jié)果

Tab.1The results of amplicon-sequencing

2.4巢式PCR擴增子建庫測序iSNVs分析基于與Bowtie2比對的結(jié)果，用SAMTOOLS 軟件對iSNVs進行比對。由表2可知，3個樣品均識別出了iSNVs，平均突變深度為64。對27個iSNVs進行了深入研究，突變頻率最低為0.02，最高為0.8。在特殊情況下，參考堿基突變?yōu)榈皖l率的兩個不同堿基。結(jié)果發(fā)現(xiàn)27個iSNVs中有15個發(fā)生在逆轉(zhuǎn)錄(reverse transcription， RT)區(qū)域，有13個突變頻率≤20%的iSNVs，表明低頻突變在大多數(shù)HBV患者中廣泛流行。RT區(qū)的突變出現(xiàn)在所有低拷貝數(shù)和中等拷貝數(shù)樣品中，而在高拷貝數(shù)樣品中幾乎沒有突變。

3 討論

HBV是已知感染人類最小的DNA病毒，基因組僅有3.2 kb左右。HBV基因組是部分雙鏈結(jié)構(gòu)，存在有2處缺口[6]，導(dǎo)致了HBV全長基因組擴增困難。1995年Gunther等[7]設(shè)計出避免延伸跨越缺口區(qū)的引物，解決了一步法擴增出HBV基因全長的問題，但對低拷貝的樣本靈敏度不高。為了解決靈敏度不高的問題，陸續(xù)有研究[8-10]提出采用巢式PCR法擴增HBV基因組，并成功擴增了低拷貝數(shù)HBV基因組樣本。前期，本研究嘗試采用一步法擴增低拷貝HBV樣本基因組，結(jié)果7個低拷貝樣本中有6個擴增失敗。此次采用兩步巢式PCR成功擴增了高、中、低拷貝數(shù)的HBV基因組全長，并比較了擴增子建庫和病毒核酸直接建庫對高通量測序結(jié)果的影響。

表2 3個樣品中檢測到的iSNVs情況

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比病毒核酸直接建庫測序，擴增子建庫測序在數(shù)據(jù)量需求方面具有巨大的優(yōu)勢。在本研究中，病毒核酸直接建庫測序剔除了176萬個有效讀段數(shù)據(jù)，只有幾個讀數(shù)可以匹配到HBV基因組。然而，擴增子建庫測序可以匹配到HBV的整個基因組。病毒核酸直接建庫測序可用數(shù)據(jù)量低，推測可能是樣本在HBV核酸提取過程中人類基因組污染造成，或者是樣本出現(xiàn)了溶血現(xiàn)象。在本研究中，盡管3個血漿樣本中HBV基因組的拷貝數(shù)差異很大，但巢式PCR測序產(chǎn)生的讀數(shù)幾乎沒有差異。此外，巢式PCR擴增建庫增加了HBV的拷貝數(shù)從而增加了測序的有效讀數(shù)量。對于低拷貝數(shù)樣本，尤其是低質(zhì)量病毒樣本，高通量測序時應(yīng)優(yōu)先選擇巢式PCR與高通量測序相結(jié)合的測序方法。這種方法不僅能夠獲得較好的數(shù)量產(chǎn)量，還能夠檢測到傳統(tǒng)測序或直接測序無法獲得的低頻堿基突變情況。

長期使用核苷(酸)類似物治療進行抗病毒治療會導(dǎo)致病毒基因組變異。基因組變異對抗病毒治療的效果的影響尚不清楚，但已有報道指出病毒基因組變異可加速疾病的發(fā)展進程[11]。本研究中，雖然未發(fā)現(xiàn)已知與核苷(酸)類似物治療相關(guān)的突變位點，但3個樣本中發(fā)現(xiàn)的27個iSNVs中的15個RT編碼區(qū)，提示使用核苷(酸)類似物治療HBV感染時要重視RT區(qū)域的突變。本研究發(fā)現(xiàn)HBV基因組RT區(qū)的所有突變均出現(xiàn)在低拷貝數(shù)和中等拷貝數(shù)樣品中，而在高拷貝數(shù)樣品中幾乎未發(fā)現(xiàn)。前期也有研究報道，HBV含量低的樣本(<105拷貝/ml)中核心蛋白(HBc)突變頻率高于HBV含量高的樣本(> 105拷貝/ml)[12]。HIV-1感染的研究中也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象，HIV-1病毒含量低(<103拷貝/ml)的樣本中基因組含有較多的抗性突變[13]。本研究表明HBV基因組的突變更容易發(fā)生在低拷貝樣本，RT區(qū)域的基因突變可能在HBV感染和治療中起著重要作用。

綜上所述，本研究建立了一種方便、經(jīng)濟有效的方法來揭示不同濃度HBV基因組和突變的完整情況，為研究HBV突變變異、基因蛋白功能、抗HBV細胞因子、乙型肝炎病患個體化檢測治療等提供了豐富的理論和技術(shù)支持。后期的研究應(yīng)該對低頻突變更加重視，特別是低拷貝數(shù)樣本中的低頻突變。

利益沖突：無

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