梁璞 伊瑤 蘇秋冬 畢勝利

102206 北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所

作為一種天然納米顆粒，病毒樣顆粒(virus-like particles，VLPs)可以將外源表位高度重復(fù)的展示在其表面，易被抗原提呈細(xì)胞識(shí)別以提高B細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力[1],已經(jīng)廣泛用于疫苗研究領(lǐng)域[2-4]，其中目前效果最好、應(yīng)用最多的就是乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)。HBcAg是由180或240個(gè)相同多肽亞單位組成的二十面體顆粒，其表面的α-螺旋組織結(jié)構(gòu)允許補(bǔ)源多肽序列插入到主要免疫顯性區(qū)域羧基端以及氨基端等多個(gè)位點(diǎn)，并保持甚至增強(qiáng)其免疫原性[5]。正確折疊和自我組裝成VLPs[2]，且對(duì)人體無細(xì)胞毒性，是制備病毒亞單位疫苗的理想載體[7]。

腸道病毒71型(EV71)是引起手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)的主要病原體，手足口病好發(fā)于5歲以下兒童，傳染性極強(qiáng)，近十年里，手足口病的年發(fā)病率一直位居我國(guó)法定傳染病報(bào)告榜首[8]。EV71是一種嗜神經(jīng)性病毒，其導(dǎo)致的手足口病更傾向于引發(fā)嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)并發(fā)癥[9-10]。EV71是屬于小RNA病毒科人腸道病毒A組(EV-A)的，單股正鏈RNA病毒，編碼VP1～VP44種結(jié)構(gòu)蛋白和7種非結(jié)構(gòu)蛋白[10-11]，VP1～VP3位于病毒衣殼表面，目前已證實(shí)VP1上的SP70與SP55線性表位可以有效刺激中和抗體產(chǎn)生，尤其是SP70表位氨基酸序列在EV71的所有基因亞型中均高度保守[12]，且免疫原性明顯強(qiáng)于SP55[13]。但單純的多肽片段免疫原性相對(duì)較差，需要強(qiáng)佐劑或是一種理想的抗原表位展示系統(tǒng)來增強(qiáng)SP70對(duì)B細(xì)胞的刺激作用。

故本研究將EV71中和表位SP70插入截短HBcAg的主要免疫顯性區(qū)域，利用原核表達(dá)系統(tǒng)，得到純化的表面重復(fù)展示SP70表位的嵌合HBc-SP70 VLPs，用以增強(qiáng)SP70的免疫原性，該基因重組VLPs可以作為備選的EV71亞單位疫苗，為下一步開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其免疫保護(hù)效果提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1主要材料與試劑E.coliBL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶NedI、XhoI以及T4連接酶購(gòu)自日本TaKaRa公司；Anti-HBc單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)abcam公司；Anti-sp70單克隆抗體購(gòu)自北京京天成生物技術(shù)有限公司；HRP Goat Anti-Mouse IgG購(gòu)自美國(guó)ABclonal公司；BCA Protein Assay Kit 購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.2制備HBcAg嵌合SP70病毒樣顆粒

1.2.1 基因合成：將位于EV71中和表位SP70(YPTFGEHKQEKDLEY)插入HBcAg截短氨基酸序列(AA1-144)中的第78與79位氨基酸殘基之間(圖1)，按照大腸埃希菌偏好對(duì)該重組蛋白HBc-SP70基因片段進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并在SP70編碼基因兩端分別加酶切位點(diǎn)BamHI和SnaBI，在重組蛋白基因片段5′端引入酶切位點(diǎn)NdeI，3′端加終止密碼子后連接酶切位點(diǎn)XhoI。之后交由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行基因合成。

圖1 HBc-SP70表達(dá)質(zhì)粒示意圖Fig.1 Schematic diagram of HBc-SP70 expression plasmid

1.2.2 構(gòu)建目的蛋白表達(dá)質(zhì)粒：重組蛋白基因片段人工合成后用限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI酶切后與經(jīng)相同酶切處理的表達(dá)載體pET-43.1 a連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃培養(yǎng)過夜。次日挑取單克隆菌落進(jìn)行培養(yǎng)及質(zhì)粒提取，并通過NdeI和XhoI雙酶切篩選陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，將測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒保存?zhèn)溆?，命名為pHBc-SP70。

1.2.3 目的蛋白HBc-SP70的表達(dá)和純化：將轉(zhuǎn)化入pHBc-SP70的E.coliBL21(DE3)接種于含氨芐青霉素(50 μg/ml)的LB培養(yǎng)基(10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 g/L NaCl)中，30 ℃震蕩培養(yǎng)過夜后加入等量新鮮LB培養(yǎng)基，37 ℃繼續(xù)震蕩培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.6左右時(shí)加入IPTG終濃度達(dá)到1 mmol/L，32 ℃繼續(xù)震蕩培養(yǎng)4 h。之后離心(4 000 g，10 min，4 ℃)收集菌體，用 mmol/L 10 Tris-HCl緩沖液(含0.01% Triton X-100，pH8.0)重懸菌體后冰上超聲破碎(200 W，作用10 s，間隔30 s，15個(gè)循環(huán))，離心(13 800 g，5 min)取上清液加入DEAE陰離子交換柱，收集未結(jié)合介質(zhì)的穿柱液，上樣完畢后用100、200、400 mmol/L的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，并收集相應(yīng)洗脫液。通過SDS-PAGE觀察目的蛋白在穿柱液及各梯度洗脫液中的分布情況。取目的蛋白所在液體組分以10%CsCl溶液墊層后離心(99 9000 g，5 h)，沉淀用PBS緩沖液重懸后進(jìn)一步做0%～60%CsCl密度梯度離心(87 000 g，16 h)，注射器抽取離心管中目的蛋白層，經(jīng)SDS-PAGE確認(rèn)后即為純化的目的蛋白HBc-SP70，用PBS 溶液在4 ℃透析過夜，于0 ℃保存。

1.3鑒定目的蛋白HBc-SP70的形態(tài)、濃度及抗原性

1.3.1 HBc-SP70的電鏡觀察：取適量目的蛋白鋪展于載網(wǎng)上，磷鎢酸染色處理，透射電鏡觀察。

1.3.2 HBc-SP70的濃度檢測(cè)：根據(jù)BCA Protein Assay Kit操作說明制備牛血清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)品和BCA工作液，之后采用微孔板方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)各孔在562 nm處的吸光值，并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/ml)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測(cè)蛋白濃度。

1.3.3 Western blot鑒定：純化的HBc-SP70 VLPs上樣15% SDS-PAGE后半干轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜(NC)，經(jīng)含5% 脫脂牛奶的TBST封閉過夜后，用anti-SP70單克隆抗體或anti-HBc單克隆抗體室溫孵育2 h，TBST洗膜3次后室溫孵育HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體1 h，洗膜后顯色。

1.3.4 ELISA鑒定：200 ng/孔HBc-SP70 VLPs包被96孔酶標(biāo)板4℃過夜，次日用含5%脫脂奶的PBST 37℃封閉2 h，加入anti-SP70單克隆抗體或anti-HBc單克隆抗體100 μl/孔37℃作用1 h，洗板后加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體37℃孵育30 min，洗板后顯色15 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm處吸光值。

2 結(jié)果

2.1嵌合HBc-SP70VLPs的構(gòu)建表達(dá)和純化如圖1構(gòu)建的重組質(zhì)粒pHBc-SP70經(jīng)NdeI和XhoI雙酶切鑒定，證實(shí)重組蛋白HBc-SP70基因片段(507 bp)表達(dá)載體pET-43.1 a，測(cè)序確認(rèn)無突變、移碼等現(xiàn)象。

SDS-PAGE分析可見，轉(zhuǎn)化入E.coliBL21(DE3) 的pHBc-SP70經(jīng)誘導(dǎo)后，在約18.3×103處有明顯目的蛋白表達(dá)條帶(圖2 A，泳道1)，表明重組質(zhì)粒pHBc-SP70在大腸埃希菌中可有效表達(dá)，之后經(jīng)超聲破碎菌、離心后，目的蛋白主要存在于上清中(圖2 A，泳道2), 而且因?yàn)椴荒芘cDEAE層析介質(zhì)結(jié)合，目的蛋白主要存在于穿柱液中，且約占穿柱液中總蛋白量的60%～70%(圖2 A，泳道3)。穿柱液經(jīng)10%CsCl溶液墊層離心后，沉淀被重懸并進(jìn)行過夜CsCl密度梯度離心，最后在10%～20%CsCl密度區(qū)間內(nèi)可見一條明顯的白色濃縮蛋白層(圖2B)，經(jīng)SDS-PAGE確定為目的蛋白HBc-SP70，且純度在90%以上(圖2C)。

A：1，pHBc-SP70經(jīng)誘導(dǎo)大量表達(dá)后的全菌蛋白；2，超聲溶菌后的離心上清液；3，DEAE離子交換層析后的穿柱液；4～6，100、200、400 mmol/L NaCl洗脫液.C：1，純化的目的蛋白圖2 目的蛋白的表達(dá)純化(A)，CsCl密度梯度離心后目的蛋白在離心管中的位置(B)SDS-PAGE鑒定圖B離心管中的純化目的蛋白(C)A: 1, The distribution of the total bacterial protein after large-scale expression; 2, The supernatant after sonication; 3, Flow through during the DEAE chromatography; 4～6, elutes washed by 100, 200, 400 mmol/L NaCl. C: 1, Purified target proteinFig.2 The expression and purification of HBc-SP70 VLPs (A), The position of HBc-SP70 VLPs in the centrifuge tube after density gradient centrifugation (B). SDS-PAGE analysis of the purified target protein in the centrifuge tube (C)

2.2嵌合HBc-SP70VLPs的鑒定在透射電鏡下，可看到大量純化融合蛋白HBc-SP70自發(fā)折疊組裝為直徑約28 nm的二十面體空心病毒樣顆粒(圖3 A)。純化后總蛋白濃度為1.11 mg/ml。

Western blot結(jié)果顯示，無論采用抗HBc或抗SP70單抗作一抗，NC膜上約18.3×103處都有一條明顯雜交帶存在(圖3B和3C)；ELISA結(jié)果也顯示，檢測(cè)抗體為抗HBc或抗SP70單抗時(shí)，包被目的蛋白的實(shí)驗(yàn)孔在450 nm處的吸光值與空白對(duì)照孔(NC)比較均顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖3D)。WB與ELISA結(jié)果均證實(shí)嵌合HBc-SP70 VLPs具有良好抗原性。

1：HBc-SP70 VLPs；2：陰性對(duì)照；NC：陰性對(duì)照；***：P< 0.001圖3 嵌合HBc-SP70 VLPs的電鏡照片(A).目的蛋白的Western blot鑒定結(jié)果：一抗為抗HBc單克隆抗體(B)，一抗為抗SP70單克隆抗體(C).目的蛋白作包被抗原，ELISA間接法鑒定結(jié)果1: HBc-SP70 VLPs; 2: negative control; NC: negative control; ***: P< 0.001.Fig.3 Electron microscopy image of the chimeric HBc-SP70 VLPs (A). Detection of purified HBc-SP70 by Western blot assay with anti-HBc monoclonal antibody (B), or with anti-SP70 monoclonal antibody (C). Detection of purified HBc-SP70 by indirect ELISA (D)

3 討論

目前雖然商品化的EV-A71滅活疫苗已投入使用，但EV71衣殼蛋白VP1與人類腦組織蛋白之間存在共同抗原表位，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高濃度的自身反應(yīng)性抗體[14]，所以全病毒疫苗具有引起自身免疫性攻擊的潛在可能，研發(fā)新的基因重組亞單位疫苗十分必要。本研究以HBcAg截短序列為嵌合VLPs骨架，一方面避免了結(jié)合感染性核酸的可能，因此在電鏡下可以清晰看到HBc-SP70VLP3為空心顆粒(圖3 A)；另一方面有研究發(fā)現(xiàn)[15]，全長(zhǎng)的HBcAg優(yōu)先激發(fā)Th1 型免疫反應(yīng)，主要與細(xì)胞免疫與局部炎癥反應(yīng)有關(guān)，而截短HBcAg則優(yōu)先激發(fā)Th2型免疫反應(yīng)，主要參與體液免疫應(yīng)答，涉及B細(xì)胞增殖分化與抗體的產(chǎn)生，因此本研究利用截短HBcAg制備的嵌合VLPs可以促使其表面展示的中和表位更有效刺激機(jī)體內(nèi)體液免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生更高效價(jià)的中和抗體預(yù)防EV71感染。另外本研究對(duì)嵌合HBc-SP70 VLPs的純化方法也做了優(yōu)化：前人研究中[13]，重組質(zhì)粒經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后37℃表達(dá)2 h，導(dǎo)致超聲破菌后，目的蛋白主要以包涵體形式存在于沉淀中，之后再經(jīng)過洗滌復(fù)性等操作，不但降低了目的蛋白表達(dá)量，而且容易造成VLP3表面抗原表位丟失，所以本研究采用32℃低溫誘導(dǎo)表達(dá)4 h，既提高了目的蛋白表達(dá)量，也使HBc-SP70融合蛋白一直以可溶狀態(tài)存在，避免了變性復(fù)性對(duì)目的蛋白免疫原性的影響；再者本研究構(gòu)建的融合蛋白羧基端沒有連接His標(biāo)簽，更利于VLPs的自發(fā)折疊組裝[16]，還可以避免刺激機(jī)體產(chǎn)生抗His標(biāo)簽抗體，而大多數(shù)抗His標(biāo)簽抗體均可與血紅素及多種正常組織結(jié)合[17]，不利于后期免疫效果評(píng)價(jià)。綜上所述，本研究構(gòu)建的嵌合HBc-SP70 VLPs不僅可以作為未來備選的EV71基因重組亞單位疫苗，對(duì)HBcAgVLP3的表達(dá)純化方法還可以廣泛應(yīng)用于制備其他疫苗、抗腫瘤藥物或者檢測(cè)試劑等。

利益沖突:無

參考文獻(xiàn)

[1] Bachman MF, Jennings GT. Vaccine delivery: amatter of size, geometry, Kinetics and molecular patterns[J].Nat Rev Immunol. 2010, 10(11):787.DOI:10.1038/nri2868.

[2] Frietze KM, Peabody DS, Chackerian B. Engineering virus-like particles as vaccine platforms[J]. Curr Opin Virol, 2016, 18(6):44-49. DOI: 10.1016/j.coviro.2016.03.001.

[3] Koho T, Ihalainen TO, Stark M, et al. His-tagged norovirus-like particles: A versatile platform for cellular delivery and surface display.[J]. Eur J Pharm Biopharm, 2015, 96(10):22-31. DOI: 10.1016/j.ejpb.2015.07.002.

[4] Thrane S, Janitzek CM, Agerbk M, et al. A Novel Virus-Like Particle Based Vaccine Platform Displaying the Placental Malaria Antigen VAR2CSA[J]. Plos One, 2015, 10(11):e0143071. DOI: 10.1371/journal.pone.0143071.

[5] Whitacre DC, Lee BO, Milich DR. Use of hepadnavirus core proteins as vaccine platforms[J]. Expert Rev Vaccines,2009,8(11):1565-1573.DOI:10.1586/erv.09.121.

[6] Ludwig C, Wagner R. Vius-like particles-universal molevulartoolboxes[J]Curr Opin Biotechnol, 2007,18(6):537-545.DOI:10.1016/j.Copbio.2007.10.013.

[7] Marks M, Stanford C, Newton P. Viral nanoparticles and virus-like particles: Platforms for contemporary vaccine design[J]. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol, 2011, 3(2):174-196. DOI: 10.1097/BRS.0b013e318199650a.

[8] Yang S, Wu J, Ding C, et al. Epidemiological features of and changes in incidence of infectious diseases in China in the first decade after the SARS outbreak: an observational trend study[J]. Lancet Infect Dis, 2017, 17(7):716-725. DOI: 10.1016/S1473-3099(17)30227-X.

[9] Yi E J, Shin Y J, Kim J H, et al. Enterovirus 71 infection and vaccines.[J]. Clin Exp Vaccine Res, 2017, 6(1):4-14. DOI: 10.7774/cevr.2017.6.1.4.

[10] Solomon T, Lewthwaite P, Perera D, et al. Virology, epidemiology, pathogenesis, and control of enterovirus 71[J]. Lancet Infect Dis, 2010, 10(11):778-790.DOI: 10.1016/S1473-3099(10)70194-8.

[11] Huang SW, Cheng HL, Hsieh HY, et al. Mutations in the non-structural protein region contribute to intra-genotypic evolution of enterovirus 71[J]. J Biomed Sci, 2014, 21(1):33. DOI: 10.1186/1423-0127-21-33.

[12] Foo DG, Alonso S, Phoon MC, et al. Identification of neutralizing linear epitopes from the VP1 capsid protein of Enterovirus 71 using synthetic peptides[J]. Virus Res, 2007, 125(1):61-68. DOI: 10.1016/j.virusres.2006.12.005.

[13] Ye X, Ku Z, Liu Q, et al. Chimeric Virus-Like Particle Vaccines Displaying Conserved Enterovirus 71 Epitopes Elicit Protective Neutralizing Antibodies in Mice through Divergent Mechanisms[J]. J Virol, 2014, 88(1):72-81. DOI: 10.1128/JVI.01848-13.

[14] Fan P, Li X, Sun S, et al. Identification of a Common Epitope between Enterovirus 71 and Human MED25 Proteins Which May Explain Virus-Associated Neurological Disease[J]. Viruses, 2015, 7(4):1558-1577. DOI: 10.3390/v7041558.

[15] Zlotnick A, Cheng N, ConwayJ F, et al. Dimorphism of Hepatitis B Virus Capsids Is Strongly Influenced by the C-Terminus of the Capsid Protein[J]. Biochemistry, 1996, 35(23):7412-7421. DOI: 10.1021/bi9604800.

[16] Majorek KA, Kuhn ML, Chruszcz M, et al. Double trouble-Buffer selection and His-tag presence may be responsible for nonreproducibility of biomedical experiments.[J]. Protein Sci, 2015, 23(10):1359-1368. DOI: 10.1002/pro.2520.

[17] 趙向絨, 張海祥, 劉楊,等. His標(biāo)簽單克隆抗體的制備及交叉抗原的表位分析[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2016, 32(5):683-687. DOI: 10.13423/j.cnki.cjcmi.007766.