王璐瑤 李丹地 孫曉曼 章青 王宏 龐立麗 胡繼宏 段招軍

730000 蘭州，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院(王璐瑤、胡繼宏); 102206 北京,中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所(李丹地、孫曉曼、章青、王宏、龐立麗、段招軍)

輪狀病毒(Rotaviruses，RVs)是引起5歲以下兒童重癥腹瀉的主要原因，世界范圍內(nèi)因RV腹瀉每年約13 000萬嬰幼兒到醫(yī)院就診，200萬例住院，約50萬嬰幼兒死亡[1]。RV感染嚴(yán)重威脅著人類健康并造成了巨大影響，給公共衛(wèi)生帶來了很大的威脅[2]。

輪狀病毒屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬，其基因組由11個雙鏈RNA節(jié)段組成，分別編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1～VP4，VP6，VP7)和6種非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1～NSP6)。在病毒侵入細(xì)胞過程中，VP4經(jīng)胰蛋白酶切割后裂解為VP5*和VP8*[3-4]，VP5*主要促進(jìn)病毒進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。而VP8*是VP4的遠(yuǎn)端，參與病毒與受體彼此作用，介導(dǎo)病毒作用宿主細(xì)胞，因此，VP8*蛋白在病毒感染中具有重要的生物學(xué)和免疫學(xué)功能[5-6]。而病毒主要依賴于宿主細(xì)胞表面的特異性受體的識別來進(jìn)行感染，因此受體是病毒感染宿主細(xì)胞的重要因素[7]。目前發(fā)現(xiàn)，僅少數(shù)動物RV是唾液酸(sialic acid，SA)敏感型毒株，可以識別細(xì)胞表面的唾液酸受體而吸附到宿主細(xì)胞上；而許多人類RV的重組VP8*蛋白可以識別人血型組織抗原(histo-blood group antigens，HBGAs)感染宿主[8]，HBGAs是一類復(fù)合糖，廣泛存在于呼吸道、生殖器和消化道的黏膜上皮細(xì)胞表面，也以游離低聚糖的形式存在于體液如唾液、腸內(nèi)容物、乳汁和血液中，可作為某些病原微生物的糖類受體被識別，與一些感染性疾病的易感性有關(guān)[9-10]。HBGAs作為RV結(jié)合受體的發(fā)現(xiàn)是輪狀病毒研究領(lǐng)域的重大突破，通過RV 與HBGAs相互作用的研究將有助于了解RV的宿主適應(yīng)性及病毒進(jìn)化和流行的規(guī)律。雖然已有研究顯示通過寡糖和唾液結(jié)合實(shí)驗(yàn)，部分P[4]、P[6]、P[8]型RV的VP8*可與HBGAs結(jié)合，且不同P基因型的RV識別的HBGAs抗原也不盡相同[11]，因此，這表明HBGAs-RV之間的結(jié)合模式以及各基因型結(jié)合的特異性還有待于進(jìn)一步的研究。為研究其受體結(jié)合特性，本研究通過P[6]基因型輪狀病毒株LL4260毒株VP8*蛋白在大腸埃希菌系統(tǒng)中的表達(dá)，為進(jìn)一步研究受體結(jié)合共性以及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料卡那霉素購自美國Sigma公司；限制性內(nèi)切酶Xho I和Nde I、cutsmart、DNA marker、T4連接酶購買于TaKaRa公司；克隆載體pET30α為本實(shí)驗(yàn)保存；感受態(tài)細(xì)胞購置于自天根生物公司；LL4260毒株VP8*全長基因質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存；HistrapH和superdex20010/300GL純化柱購自GE Heahhcare公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物合成：LL4260全長基因用核心區(qū)引物NdeI(5′-GGAATTCCATATGGTGTTGGATGGACC-3′)和XhoI(5′-CCGCTCGAGTAATCCATTATTTACGTATTC-3′)擴(kuò)增LL4260 VP8*核心區(qū)片段。

1.2.2 克隆構(gòu)建：將PCR擴(kuò)增的核心區(qū)片段用限制性內(nèi)切酶NdeI、XhoI進(jìn)行雙酶切后與用同樣酶雙酶切的pET30a載體16 ℃連接過夜，而后轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃過夜，挑單克隆搖菌后進(jìn)行質(zhì)粒提取，質(zhì)粒送天一輝遠(yuǎn)公司測序，序列正確的質(zhì)粒保留備用。

1.2.3 蛋白表達(dá)和純化：陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)中，過夜(37 ℃)，挑取單克隆到含有卡那霉素的LB瓶中過夜震蕩，取15 ml轉(zhuǎn)接到1.5 L 的含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中以溫度37 ℃、離心力180 g中培養(yǎng)約3.5 h，使OD600到達(dá)0.637，將溫度調(diào)整到22 ℃，加IPTG(使得終濃度達(dá)0.4 mmol/L)，以22 ℃，150 g誘導(dǎo)培養(yǎng)過夜。第2天收菌，1xPBS重懸，冰浴用80%功率超聲，再將超聲后的破碎液用高速離心機(jī)(13 000×g，4 ℃)離心60 min，得到的上清即為可溶性表達(dá)的VP8蛋白。收集上清用濾膜過濾后過HistrapHP柱，用濾膜過濾過的H2O、PBS、20 mmol/L咪唑、50 mmol/L咪唑、300 mmol/L咪唑緩沖液各沖洗30 ml。用各濃度的洗脫液進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠(SDS—PAGE)電泳，經(jīng)過考馬斯亮藍(lán)染色與水煮脫色?？梢詸z測出所需要的蛋白的目的條帶。

1.2.4 分子篩層析：將鑒定好的目的蛋白用超速離心管按照3000×g離心濃縮到1.0 ml左右，吸出備用；先用已過濾好的水平衡superdex 200 s柱子，再用20/50(20 mmol/L Tris和50 mmol/L NaCl,pH=8.0)的緩沖液均衡一個柱體積。將濃縮的樣品用上樣環(huán)上樣后進(jìn)行分子篩層析，根據(jù)UV280 nm的吸收值收集樣品，根據(jù)所得的峰值以及收集得到樣品的SDS-PAGE電泳結(jié)果來分析蛋白。

2 結(jié)果

2.1基因擴(kuò)增和克隆構(gòu)建利用核心區(qū)引物PCR擴(kuò)增得到LL4260 VP8*core基因片段500 bp)。通過酶切連接，構(gòu)建得到pET30 a-LL4260VP8*core克隆，挑取單克隆提取質(zhì)粒送測序，測序正確后保留備用。

2.2蛋白表達(dá)重組質(zhì)粒pET30 a-LL4260VP8*core轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)蛋白。通過HistrapHP柱進(jìn)行親和層析，并用不同濃度的咪唑洗脫液洗蛋白。結(jié)果表明通過50和300 mmol/L咪唑均可洗脫得到目的蛋白，但是300 mmol/L洗脫的純度較高，而50 mmol/L的量較大。如圖1所示。

圖1 LL4260 VP8*核心區(qū)蛋白純化1、2、3和4分別是PBS、20 mmol/L、50 mmol/L、300 mmol/L咪唑洗脫的樣品Fig.1 The purification of LL4260 VP8*core proteins．1，2，3 and 4 refer to the elution of PBS，20 mmol/L，50 mmol/L and 300 mmol/L imidazole buffer

2.3蛋白純化蛋白在超濾管濃縮后，通過superdex20010/300GL柱進(jìn)行分子篩，從而進(jìn)一步進(jìn)行蛋白純化，結(jié)果顯示蛋白在大約18 ml左右開始出峰，而SDS-PAGE顯示蛋白相對分子質(zhì)量為22×103左右，純度可達(dá)到85%以上，如圖2所示。

圖2 LL4260 VP8*核心區(qū)蛋白分子篩層析結(jié)果：圖中橫軸代表樣品出峰的位置(單位為ml)，縱軸代表樣品在280 nm處的UV吸收值Fig.2 The gel filtration results of pET30 a-LL4260VP8*core proteins. The horizontal axis refers to the position of the protein peak (the unit is milliliter). The vertical axis refers to the absorbance at UV 280 nm

3 討論

輪狀病毒引起的急性腸胃炎是兒童腹瀉中高致病率的重要病因，目前缺乏有效的治療措施，疫苗是控制輪狀病毒感染的唯一有效措施。VP8*蛋白是病毒吸附進(jìn)入宿主細(xì)胞的功能性蛋白，在病毒與宿主細(xì)胞互相作用中起重要作用。感染人的最常見VP4*基因型為P[4]、P[6]、P[8]，3個主要P基因型占所有輪狀病毒的99%[12]。感染豬的最常見VP4*基因型為P[6]、P[7][13]。P[6]基因型輪狀病毒毒株首次在美國患腹瀉乳豬的腸內(nèi)容物中被發(fā)現(xiàn)，隨后發(fā)現(xiàn)P[6]基因型逐漸成為豬輪狀病毒的最主要流行株[14]。而P[6]基因型人輪狀病毒最初發(fā)現(xiàn)于無癥狀感染的新生兒[15]，隨后很快成為人類輪狀病毒感染的一個主要流行基因型[16]。目前研究發(fā)現(xiàn)大量人豬重配或重組毒株與P[6]基因型輪狀病毒相關(guān)。

HBGAs是通過糖基轉(zhuǎn)移酶識別其前體糖鏈并漸漸添加單糖而合成的糖復(fù)合物[17]。不同血型的個體可以感染不同P型RV，人類HBGAs的遺傳多樣性及RV基因型的多樣性可能導(dǎo)致RV易感性的差異。而RV流行的最主要基因型P[4]、P[6]和P[8]與HBGAs結(jié)合的結(jié)構(gòu)和功能基礎(chǔ)還不清楚[11]。本研究選取的是人P[6]基因型輪狀病毒LL4260毒株，通過對其VP8*基因克隆和蛋白表達(dá)得到VP8*核心區(qū)的蛋白。

本研究選擇載體pET30a，僅在下游引物中加入終止密碼子和6個組氨酸(his標(biāo)簽)，利用his標(biāo)簽進(jìn)行蛋白純化，所表達(dá)純化的蛋白僅在C端多了6個組氨酸，避免因氨基酸引入干擾蛋白功能和結(jié)晶?？扇苡谏锨宓谋磉_(dá)蛋白通過與純化柱結(jié)合，先用低濃度的咪唑溶液去除雜蛋白，再用高濃度的咪唑洗脫液洗下目的蛋白。本研究選擇P[6]基因型輪狀病毒LL4260毒株VP8*核心區(qū)進(jìn)行pET30 a-LL4260VP8*core蛋白的表達(dá)，利用分子篩層析進(jìn)行蛋白純化，SDS-PAGE電泳顯示目的蛋白純度較好，相對分子質(zhì)量為22×103。可直接用于受體結(jié)合等功能研究及蛋白結(jié)晶結(jié)構(gòu)研究。

綜上，本研究構(gòu)建了P[6]基因型輪狀病毒LL4260毒株VP8*核心區(qū)的pET30 a-LL4260VP8*core重組質(zhì)粒，表達(dá)純化得到相應(yīng)核心區(qū)目的蛋白，為進(jìn)一步的功能學(xué)研究和晶體結(jié)構(gòu)學(xué)研究打下基礎(chǔ)，也將為RV新型疫苗和藥物研制及預(yù)防控制手段和策略的實(shí)施提供參考。

利益沖突:無

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