閆芳域 殷強(qiáng)玲 李阿茜 蕪為 李川 梁米芳 李德新 李建東

102206 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所

隨著全球經(jīng)濟(jì)一體化及現(xiàn)代交通運(yùn)輸方式的快速發(fā)展，傳染病跨境傳播的風(fēng)險不斷加大。多種危害嚴(yán)重的重要傳染病，如埃博拉(ebola virus disease， EVD)、馬爾堡(marburg virus disease, MVD)、黃熱病(yellow fever, YF)、拉沙熱 (lassa fever, LF)、克里米亞-剛果出血熱病毒(crimean-congo hemorrhagic fever, CCHF)、裂谷熱(rift valley fever, RVF)、基孔肯雅熱(chikungunya fever, CHIK)等均源于非洲[1-3]。我國與非洲交往日益增多，非洲重要病毒病存在輸入國內(nèi)的風(fēng)險。本研究針對在非洲高發(fā)且具有嚴(yán)重公共衛(wèi)生危害的重要病毒病，以Luminex微流系統(tǒng)為平臺，建立基于熒光微球的核酸多元檢測方法，并完成了初步的評價。

1 材料與方法

1.1材料RVFV、 CCHFV、MARV、 ZEBOV、LASV的N、GP基因，和CHIKV的E1基因和YFV NS5基因由公司化學(xué)合成。xMAP熒光微球購自Bio-Rad公司，1.2 μm的96孔濾模板購自Millipore公司。

1.2引物和探針應(yīng)用Primer Express 3.0(美國Thermo公司)設(shè)計引物和探針，并用primer-BLAST驗(yàn)證特異性。在探針5′端進(jìn)行12個碳原子連接臂的氨基修飾以偶聯(lián)微球。在反向通用引物的5′端引入生物素標(biāo)記。

1.3參考品及模擬樣本制備使用帶有T7啟動子序列的引物，擴(kuò)增上述病毒基因序列，作為模板，采用RiboMAX large scale RNA production systems SP6/T7 kit (美國Promega公司) 進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。DNase I進(jìn)行消化后，使用RNeasy Mini Kit(德國Qiagen公司) 進(jìn)行純化。并用Nano drop和凝膠電泳的方法進(jìn)行定量。

1.4基于熒光微球的核酸檢測檢測過程包括熒光微球與探針偶聯(lián)、樣本核酸提取、多重PCR擴(kuò)增、雜交檢測等過程。

1.4.1 熒光微球與探針偶聯(lián)：參照試劑盒說明書，使用EDC(美國Thermo公司)將氨基修飾的探針和羧基修飾的微球在室溫避光條件下偶聯(lián)，微球避光儲存于4 ℃條件。

1.4.2 PCR擴(kuò)增：采用One Step RT-PCR kit試劑盒(德國Qiagen公司)進(jìn)行Tem-PCR擴(kuò)增[7]，分為5個階段，①反轉(zhuǎn)錄50 ℃ 30 min, ②熱啟動95 ℃ 10 min, ③加標(biāo)簽 95 ℃ 30 s, 60 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min共10個循環(huán)，④大規(guī)模擴(kuò)增 95 ℃ 30 s, 48℃1 min, 72℃1 min共30個循環(huán)。⑤延伸 72 ℃ 7 min。

1.4.3 雜交檢測： 一個反應(yīng)體系中包括33 μl 1.5×TMAC微球溶液，約含有5 000個熒光微球，10 μlTris-EDTA溶液(pH=8.0)，7 μl多重PCR產(chǎn)物。設(shè)置3個復(fù)孔，在95 ℃ 3 min；50℃30 min條件下孵育。產(chǎn)物移入被鞘液潤濕的在50 ℃條件下預(yù)熱的96孔濾模板中，真空泵抽濾，加入100 μl，1.5×TMAC溶液，輕微震蕩后真空泵抽濾，加入使用1×TMAC溶液稀釋的3 μg/ml的鏈霉親和素-藻紅素(美國Prozyme公司)溶液，50 ℃條件下避光孵育10～5 min。真空泵抽濾后加入100 μl 1.5×TMAC使用Luminex Calibrate Kit(美國Bio-Rad公司)調(diào)試Luminex Bioplex 200，按照操作手冊上機(jī)檢測讀值，并以熒光中位值(Median fluorescence intensity, MFI) ≥陰性對照均值+3倍標(biāo)準(zhǔn)差為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.5檢測限、特異性及穩(wěn)定性評價對RNA參考品進(jìn)行10倍系列稀釋，達(dá)到101～108拷貝/ μl，評價檢測限并與Real-time PCR方法對比。分別選取105和107拷貝/μl的參考品，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，每次設(shè)置3個復(fù)孔，計算其組內(nèi)和組間變異系數(shù)，評價穩(wěn)定性。選用30份ZIKA、DENV和SEOV病毒等疑似病例樣本、7種病毒核酸模擬樣本及32份正常人血清樣本評價方法的特異性。

2 結(jié)果

2.1引物和探針設(shè)計引物、探針模擬驗(yàn)證后，采用Tem-PCR原理[4]，在正反向引物5′末端添加通用引物(表1)，實(shí)現(xiàn)靶基因片段多重擴(kuò)增的。

2.2參考品制備以公式RNA濃度(拷貝/ μl)=濃度(g/ μl) ×6.02×1023/轉(zhuǎn)錄片段長度(核糖核酸數(shù)量)×340計算出參考品濃度。定量之后10倍系列稀釋，獲得101-108拷貝的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。

2.3檢測限利用10倍系列稀釋的RNA參考品分別進(jìn)行單重和7重的核酸檢測， 繪制檢測曲線(圖1)，與Real-time PCR方法的檢出限對比 (表2)。

2.4特異性選取108拷貝/ μl 7種病毒的的RNA為模擬樣本，進(jìn)行交叉反應(yīng)檢驗(yàn)，結(jié)果顯示7種病原體之間無明顯非特異性交叉反應(yīng)；對30份寨卡病毒(Zika virus, ZIKA)、登革病毒(Dengue virus, DENV)和漢城病毒(Seoul virus, SEOV)的模擬患者標(biāo)本、32份健康人血清標(biāo)本進(jìn)行檢測，特異性為100%(圖2)。

2.5穩(wěn)定性對濃度為105拷貝/ μl和107拷貝/ μl 的7種病原靶基因參考品進(jìn)行3次重復(fù)性檢測，結(jié)果顯示組內(nèi)變異系數(shù)均小于12%，組間變異系數(shù)均小于15%，經(jīng)方差分析P>0.11，組內(nèi)組間測量值統(tǒng)計學(xué)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，(圖3)。

A:RVFV; B: YFV; C:MARV; D:ZEBOV; E:LASV; F:CCHFV; G: CHIKV圖1 不同濃度病毒RNA多重檢測曲線Fig.1 Multiplex detection curves of viral RNA under different concentration

圖2 基于熒光微球的核酸檢測方法的特異性評價Fig.2 Evaluation of specificity of the fluorescent bead-based multiplex PCR assay

A: 樣本濃度為107拷貝/ μl; B: 樣本濃度為105拷貝/ μl圖3 基于熒光微球的核酸檢測方法的穩(wěn)定性評價A: Sample concentration at 107copies/ μl; B: Sample concentration at 105copies/ μlFig.3 Evaluation of the reproducibility of the fluorescent bead-based multiplex PCR assay

3 討論

隨著航空業(yè)的快速發(fā)展，國家間經(jīng)貿(mào)合作交流的增加，傳染病跨界傳播的風(fēng)險不斷加大。2016年，安格拉黃熱疫情暴發(fā)，中國報道了11例輸入性病例[5]。2014年，西非埃博拉疫情大暴發(fā)，病例傳入美國、英國等國家，并在尼日利亞，剛果引發(fā)暴發(fā)疫情[6]。登革熱、基孔肯雅熱、黃熱等蟲媒傳染病，均不斷發(fā)生跨境傳播，引起全球范圍的流行[7]。

表1 七種非洲地區(qū)多發(fā)病毒病核酸檢測引物與探針序列Tab.1 The primers and probes of seven viral diseases with a high incidence in Africa

*：本研究中所用探針均在5′端偶聯(lián)12個碳原子，充當(dāng)連接臂，并進(jìn)行氨基修飾，以便偶聯(lián)到熒光微球表面

*: All the probes in this research are coupled with 12 C atoms at 5′ end as a link arm and were amino-modified to connect to the surface of the fluorescent beads

目前，病毒病的實(shí)驗(yàn)室檢測方法主要包括檢測病毒抗體的血清學(xué)檢測方法，檢測病毒抗原、核酸以及分離病毒等病原學(xué)檢測方法。Real-time PCR方法經(jīng)濟(jì)、簡單、方便，廣泛用于特定病原體檢測、監(jiān)測或常見病的檢測，但由于通量的限制，難以用于罕見病原體的篩查。Luminex等基于熒光微球的核酸檢測平臺利用微球和不同熒光編碼技術(shù)，可以針對少量樣本開展高通量檢測。在血清學(xué)特異性抗體檢測中，由于整個檢測過程均在液相中進(jìn)行，增加了反應(yīng)接觸面積和幾率，較經(jīng)典ELISA反應(yīng)具備更高的敏感性和特異性[8-9]?；谠擁?xiàng)技術(shù)的核酸檢測方法，在國內(nèi)、外也開展相關(guān)研究，主要集中在呼吸道病毒和腸道病毒的組合檢測中，臨床樣本檢出率可達(dá)80%～100%，針對呼吸道病毒的商業(yè)化試劑盒，檢測限約為10-1TCID50，特異性為95%～100%[10]。

表2 單重和多重檢測及Real-time PCR的敏感性分析

Tab.2Analytical sensitivity of single and multiple test and real-time PCR

本研究中建立的7種非洲地方性流行的病毒病多元檢測方法包括樣本核酸提取、核酸特異性擴(kuò)增富集、分子雜交和基于熒光微球的檢測4個模塊，為了增加反應(yīng)的靈敏性，分模塊對反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，檢出限約為102-5拷貝/ μl，為可能輸入的重要傳染病檢測提供新的手段和方法。基于熒光編碼微球的檢測技術(shù)，反應(yīng)物在液相間相互作用，與自然狀態(tài)下的作用環(huán)境相似，有助于提升檢測的敏感性和特異性。同時，隨著編碼技術(shù)和微流系統(tǒng)的改進(jìn)以及檢測過程的不斷優(yōu)化，基于熒光微球的檢測技術(shù)將得到更廣泛的應(yīng)用。

利益沖突:無

參考文獻(xiàn)

[1] Petersen J, Simons H, Patel D. Amplification of perceived risk among users of a national travel health Web site during the 2013-2016 West African Ebola virus outbreak[J].Am J Infect Control, 2018,pii:s0196-6553(17)31257-31259.DOI: 10.1016/j.ajic.2017.11.012.

[2] Buba MI, Dalhat MM, Nguku PM， et al. Mortality Among Confirmed Lassa Fever Cases During the 2015-2016 Outbreak in Nigeria[J]. Am J Public Health, 2018，108(2): 262-264. DOI: 10.2105/ajph.2017.304186.

[3] Pigott DM, Deshpande A, Letourneau I， et al. Local, national, and regional viral haemorrhagic fever pandemic potential in Africa: a multistage analysis[J]. Lancet, 2017， 390(10113): 2662-2672. DOI: 10.1016/s0140-6736(17)32092-5.

[4] Han J, Swan DC, Smith SJ, et al. Simultaneous amplification and identification of 25 human papillomavirus types with Templex technology [J]. J Clin Microbiol, 2006，44(11): 4157-4162. DOI: 10.1128/jcm.01762-06.

[5] Ling Y, Chen J, Huang Q， et al. Yellow Fever in a Worker Returning to China from Angola, March 2016[J]. Emerg Infect Dis, 2016，22(7):1317-1818. DOI: 10.3201/eid2207.160469.

[6] Dixon MG, Schafer IJ. Ebola viral disease outbreak—West Africa, 2014[J]. MMWR Morb Mortal Wkly Rep， 2015,65(1):114-115. DOI: 10.1016/j.annemergmed.2014.10.010.

[7] Cella E, Riva E, Salemi M et al. The new Chikungunya virus outbreak in Italy possibly originated from a single introduction from Asia[J]. Pathog Glob Health, 2017，11(28):1-3. DOI: 10.1080/20477724.2017.1406565.

[8] Wu W, Zhang S, Qu J， et al. Simultaneous detection of IgG antibodies associated with viral hemorrhagic fever by a multiplexed Luminex-based immunoassay[J]. Virus Res, 2014，187(1): 84-90. DOI: 10.1016/j.virusres.2013.12.037.

[9] Kamminga S, van der Meijden E, Wunderink HF， et al. Development and evaluation of a broad bead-based multiplex immunoassay to measure IgG seroreactivity against human polyomaviruses[J]. J Clin Microbiol, 2018，01(1): 115-118. DOI: 10.1128/jcm.01566-17.

[10] Munro SB, Kuypers J, Jerome KR. Comparison of a multiplex real-time PCR assay with a multiplex Luminex assay for influenza virus detection[J]. J Clin Microbiol， 2013，5(1):1124-1129. DOI: 10.1128/jcm.03113-12.