王東紅 裘丹紅 翁堅(jiān) 盛瑩 林海江 林春萍 孔超 周靜曉 沈偉偉

318000 臺(tái)州市疾病預(yù)防控制中心(王東紅、裘丹紅、翁堅(jiān)、盛瑩、林海江、沈偉偉)；318020 臺(tái)州市黃巖區(qū)疾病預(yù)防控制中心(林春萍、孔超、周靜曉)

登革病毒(dengue virus, DENV)是單股正鏈RNA病毒，含有一個(gè)長(zhǎng)的開放讀碼框，編碼7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS2A、NS2B、NS1、NS3、NS4B、NS4A和NS5)和3種結(jié)構(gòu)蛋白(E、C和prM)[1]。基因組全長(zhǎng)約11 kb，其中E基因全長(zhǎng)1 485 bp，編碼E蛋白相對(duì)分子質(zhì)量54.5×103，E蛋白是重要的抗原成份，與受體識(shí)別有關(guān)。E基因區(qū)域的重組對(duì)病毒的適應(yīng)性及進(jìn)化具有潛在意義，也是登革病毒分型的依據(jù)[2-3]。

本研究針對(duì)2016年10月在浙江省臺(tái)州市黃巖區(qū)暴發(fā)的3例登革熱病例進(jìn)行研究。這3例患者經(jīng)實(shí)驗(yàn)室診斷為I型登革病毒感染，采集患者急性期血清分別進(jìn)行了NS1抗原檢測(cè)、IgM、IgG抗體和核酸檢測(cè)；用白蚊伊蚊細(xì)胞(C6/36)分離培養(yǎng)，PCR擴(kuò)增3株病毒的E基因序列并與NCBI中已公布的基因序列進(jìn)行比對(duì)并進(jìn)行進(jìn)化分析，探討其輸入來(lái)源與基因型別。

1 材料與方法

1.1材料登革患者急性期血清。登革熱NS1快速檢測(cè)試劑、登革熱IgM/IgG快速檢測(cè)卡購(gòu)自深圳市科潤(rùn)達(dá)生物工程有限公司、磁珠法提取RNA試劑盒(life technology: Amb18365)、DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、谷氨酰胺、青鏈霉素、胎牛血清購(gòu)自杭州昊天生物技術(shù)有限公司；C6/36細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2方法

1.2.1 血清學(xué)檢測(cè)：應(yīng)用登革熱NS1快速檢測(cè)試劑、登革熱IgM/IgG快速檢測(cè)卡對(duì)采集的血清進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)操作和實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷參照試劑說(shuō)明書。

1.2.2 病毒分離：將患者急性期血清，按照1∶10稀釋，取100 μl接種到長(zhǎng)成單層的C6/36細(xì)胞分離培養(yǎng)。28℃吸附1 h，棄掉上清，加入含有1%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，置28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。從第二天開始觀察細(xì)胞病變情況，一般需要培養(yǎng)7 d才能觀察到細(xì)胞病變，如果沒有病變，則盲傳3代接種細(xì)胞，盲傳3代無(wú)細(xì)胞病變則為陰性。

1.2.3 登革病毒型別鑒定：取100 μl病毒分離培養(yǎng)液，采用磁珠法提取病毒RNA，操作步驟見說(shuō)明書。引物采用通用和特異性熒光對(duì)登革病毒進(jìn)行型別鑒定。引物序列和反應(yīng)條件參考登革熱診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS 216-2008)。

1.2.4 E基因序列測(cè)定：E基因擴(kuò)增引物參考文獻(xiàn)[4]，F(xiàn)1: 5′-GCTTTGCGACACCCAGGATTC-3′；R1: 5′-GCACEAGTCAACGCAGTG-3′；F2: 5′-GCAAAGAAGCAGGAAGTAGTCGTA-3′；R2: 5′-TGCTGATAGTCTTTTTGGGGAGTC -3′。引物由北京六合華大基因有限公司合成。用一步法RT-PCR對(duì)提取的病毒RNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：50 ℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，45個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增的全長(zhǎng)E基因片段經(jīng)純化，送北京六合華大基因有限公司測(cè)定。

1.2.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建：測(cè)得的E基因片段采用Seqman(7.1.0)軟件進(jìn)行拼接。用BLAST分析其一致性最高的基因序列來(lái)源，用MEGA6.0軟件采用相鄰連接法(Neighbor-Joining Method)對(duì)E 基因序列進(jìn)行進(jìn)化分析。從GenBank查找24株DENV-I國(guó)內(nèi)外流行株和參考株的E基因序列進(jìn)行進(jìn)化分析[5]，以DENV-3作為樹外對(duì)照株(GenBank ID: AY744678)。

2 結(jié)果

2.1病毒分離用C6/36細(xì)胞對(duì)3例登革病毒急性期血清進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)，培養(yǎng)5 d后，細(xì)胞出現(xiàn)融合，空泡、腫脹、細(xì)胞壞死和脫落等細(xì)胞病變現(xiàn)象。共分離出3株登革病毒。細(xì)胞接種病毒前(圖1 A)和接種病毒5 d后(圖1B)的狀態(tài)見圖1。

A,接種前；B,接種后5 d
圖1 患者血清標(biāo)本接種C6/36細(xì)胞后出現(xiàn)細(xì)胞病變
A,Before incoulation;B,5 d after inoculation
Fig.1 Cytopathic effects of C6/36 cell lines caused by inoculation of serum samples from patients

2.2患者基本信息及登革病毒特異檢測(cè)結(jié)果通過(guò)熒光RT-PCR對(duì)登革病毒進(jìn)行分型，所有的登革病毒均為DENV-I型。對(duì)3例登革病例進(jìn)行NS1抗原、IgM/IgG抗體和核酸進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表1所示。

表1 3例登革病例實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果

Tab.1Laboratory test results of three dengue fever cases

2.3E基因序列測(cè)定結(jié)果3株病毒E基因全長(zhǎng)均為1 485個(gè)核苷酸，編碼495個(gè)氨基酸。核苷酸同源性均為99.87%，氨基酸同源性為99.6%～99.8%。3株病毒與DENV-3核苷酸同源性為70.4%～70.6%。3株病毒編號(hào)分別為D1/TZ15/China/2016、D1/TZ16/China/2016、D1/TZ19/China/2016(Genbank ID: KY886977、KY886978、KY886979)。

2.4E基因BLAST及同源性分析通過(guò)BLAST與GenBank中已公布的E基因序列進(jìn)行比對(duì)，3株病毒與湖北株(KP772252/HB22/CHN/2014)、廣州株(KR028435/G2/02/2014)均具有較高的一致性，核苷酸同源性分別為99.87%～100%、99.80%～99.93%。其中D1/TZ15/China/2 016株與湖北株(KP772252/HB22/CHN/2014)有相同的核苷酸序列。

注：●臺(tái)州市本地感染病毒株；▲各亞型登革病毒代表株
圖2 臺(tái)州市I型登革病毒E基因系統(tǒng)進(jìn)化樹
Note: ●Indicates local infection virus strains; ▲Indicates representative Dengue virus strains
Fig.2 Phylogenetic analysis of E gene of dengue virus type I from Taizhou

2.5系統(tǒng)進(jìn)化分析3株登革病毒E基因全長(zhǎng)序列與GenBank查找24株DENV-I國(guó)內(nèi)外流行株和參考株的E基因序列進(jìn)行進(jìn)化分析。根據(jù)Rico-Hesse 基因分型法，DENV-I型分為Genotype I～ Genotype V五個(gè)亞型[5]。用MEGA6.0相鄰連接法(Neighbor-Joining Method)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示這3株病毒在同一進(jìn)化分支上，屬于Genotype I，與湖北株(KP772252/HB22/CHN/2014)、廣州株(KR028435/G2/ZW-0802/2014)、廣州株(KT428609/GZ/92/2014)親緣關(guān)系較近，并與東南亞KJ806871/Malaysia/2014、KJ806872/Singapore/2014病毒株在同一進(jìn)化分支上。

3 討論

登革病毒是一種通過(guò)埃及伊蚊和白紋伊蚊傳播的蟲媒病毒，自然界存在4種血清型(DENV-Ⅰ、DENV-Ⅱ、DENV-Ⅲ、DENV-Ⅳ)，可引起登革熱、登革出血熱和登革休克綜合癥等急性傳染病[6]。登革熱已成為嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)生問題，廣泛流行于熱帶和亞熱帶的100 多個(gè)地區(qū)和國(guó)家。我國(guó)于1978—1990年在廣東省、廣西省等地發(fā)生過(guò)幾次較大的登革熱流行，2014年廣東省暴發(fā)了自1986年以來(lái)最大的一次登革熱疫情，共有44 894例患者，死亡6例[7-8]。2014年湖北也暴發(fā)了登革熱輸入病例。浙江省歷史上共發(fā)生兩起本地登革熱疫情，于2004年在浙江慈溪市暴發(fā)I型登革熱疫情，導(dǎo)致113例發(fā)病[9]；2009年義烏市暴發(fā)3型登革熱疫情，導(dǎo)致180例發(fā)病[10]。2016年浙江省臺(tái)州市暴發(fā)I型本地感染登革熱疫情，導(dǎo)致3例發(fā)病。

本次研究的登革病毒進(jìn)化分析顯示，這3株病毒與湖北株(KP772252/HB22/CHN/2014)、廣州株(KR028435/GZ/02/2014)和廣州株(KT428609/GZ/92/2014)親緣關(guān)系較近。廣州株(KR028435/GZ/02/2014)為2014年廣東登革疫情暴發(fā)的代表株[8]，該株病毒主要來(lái)源于馬來(lái)西亞、新加坡。湖北株(KP772252/HB22/CHN/2014)的傳播來(lái)源于廣東、東南亞，與廣州株(KR028435/GZ/ 02/2014)在同一進(jìn)化分支上。同時(shí)進(jìn)化樹也表明這3株病毒與東南亞病毒株KJ806871/Malaysia/2014、KJ806872/Sing-apore/2014也具有較高的一致性。臺(tái)州市暴發(fā)的3例登革熱病例兩月內(nèi)均沒有外出旅行史，不屬于首發(fā)病例，也不能確定屬于幾代病例。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明此次臺(tái)州本地登革疫情暴發(fā)可能是首發(fā)病例去過(guò)廣東或東南亞，回到臺(tái)州未出現(xiàn)典型癥狀，未及時(shí)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)多次傳播，導(dǎo)致本地暴發(fā)流行。

目前我國(guó)尚未形成登革病毒地方流行區(qū)[9]，浙江省臺(tái)州市地處亞熱帶，與廣東、東南亞貿(mào)易頻繁，蚊媒密度高，存在登革病毒傳播和生長(zhǎng)的條件，極易使輸入傳染病變成地方傳染病，存在二代病例感染風(fēng)險(xiǎn)。臺(tái)州往年以輸入病例為主，是首次本地暴發(fā)流行。本次臺(tái)州市本地暴發(fā)登革熱疫情提示應(yīng)加強(qiáng)登革熱的防控意識(shí)，加強(qiáng)對(duì)登革熱及其病毒檢測(cè)；加強(qiáng)登革熱相關(guān)專業(yè)知識(shí)的培訓(xùn)，提高醫(yī)務(wù)人員的診斷能力。

利益沖突:無(wú)

參考文獻(xiàn)

[1] Jiang LY，Jing QL，Liu Y，et al. Molecular characterization and genotype shift of dengue virus strains between 2001 and 2014 in Guangzhou[J]. Epidemiol Infect, 2017, 145(4): 760-765. DOI:10.1017/S0950268816002429.

[2] Guzman MG, Harris E. Dengue[J]. The Lancet, 2015, 385(9966):453-465.DOI:10.1016/ s0140-6736(14)60572-9.

[3] Hermann LL, Gupta SB, Manoff SB, et al. Advances in the understanding, management, and prevention of dengue[J]. J Clin Virol, 2015, 64:153-159. DOI:10.1016/j.jcv.2014.08. 031.

[4] 周經(jīng)姣, 方周云, 晏輝鈞, 等. 登革1型病毒廣州分離株全長(zhǎng)E基因序列測(cè)定與分析[J]. 中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào), 2007, 23(1)：48-52. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2007.01. 012.

[5] Goncalvez AP, Escalante AA, Pujol FH, et al.Diversity and evolution of the envelope gene of dengue virus type 1[J]. Virology, 2002, 303(1):110-119. DOI:10.1006/viro.2002. 1686.

[6] Bhatt S, Gething PW, Brady OJ, et al. The global distribution and burden of dengue[J]. Nature, 2013, 496(7446):504-507. DOI:10.1038/nature 12060.

[7] 應(yīng)若素, 王建, 洪文昕, 等. 廣東省2014年登革熱暴發(fā)流行的臨床和實(shí)驗(yàn)室特點(diǎn)[J]. 中華傳染病雜志, 2014 32(12):719-723. DOI:10.3760/cma.j.issn.1000-6680.2014.12. 004.

[8] Wang P, Wang H, Yu J, et al. Molecular characterization and phylogenetic analysis of dengue virus type 1 in Guangdong in 2014[J]. Springer open, 2016, 5(1):1942. DOI:10.1186/s40064-016-3604-4.

[9] 嚴(yán)菊英, 盧亦愚, 翁景清, 等. 浙江省登革熱暴發(fā)疫情的病原學(xué)和分子生物學(xué)研究[J]. 病毒學(xué)報(bào), 2006:22(25):339-344. DOI:10.3321/j.issn:1000-8721.2006.05. 003.

[10] 嚴(yán)菊英, 張嚴(yán)峻, 茅海燕, 等. 2009年浙江省義烏市登革熱暴發(fā)疫情實(shí)驗(yàn)診斷和病原分子溯源[J]. 中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志, 2010:44(12):1091-1096. DOI:10.3760/cma.j.issn. 0253-9624.2010.12.007.