黃盼盼 趙莉 任皎 趙穎 阮力 譚文杰 田厚文

102206 北京，中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所

痘苗病毒(vaccinia virus, VACV)屬于痘病毒科正痘病毒屬，是研究痘病毒基礎生物學、毒力、宿主范圍以及病毒與宿主細胞相互作用和宿主免疫反應的模式病毒[1]。痘苗病毒早期作為天花疫苗在人類消滅天花的戰(zhàn)役中起到關(guān)鍵的作用，自1980年世界衛(wèi)生組織宣布人類成功消滅天花后，痘苗病毒被引入實驗室中作為基因表達載體廣泛被用于多種感染性疾病以及癌癥的預防和治療。由于人類免疫缺陷病毒(HIV)感染、癌癥治療和器官移植等醫(yī)療過程中需要進行免疫抑制，研究人員為了提高痘苗病毒載體的安全性，對其進行改造，獲得了在多數(shù)人源細胞中無法有效復制的毒株，即復制缺陷型痘苗病毒[2]。

目前國外復制缺陷型痘苗病毒有：修飾的痘苗病毒安卡拉株(modified vaccinia Ankara, MVA)和NYVAC；國內(nèi)是痘苗病毒天壇株(vaccinia virus Tiantan, VTT)的衍生株：復制缺陷型痘苗病毒天壇株(NTV)。MVA 是安卡拉株在雞胚成纖維細胞(chicken embryo fibroblasts, CEF)中自然傳代570次，丟失了15%的基因[3]；NYVAC為痘苗病毒哥本哈根株(vaccinia virus Copenhagen, VACV-Cop)用基因重組技術(shù)人為刪除了18個開放閱讀框(open reading frame, ORF)[4]；NTV則是阮力等[5]通過基因工程技術(shù)缺失位于基因組C到K區(qū)的26個基因。這些基因的缺失影響了3株病毒的宿主范圍、免疫逃逸和毒力等特性，導致它們在多數(shù)人源細胞中無法有效復制，這些細胞被稱為病毒的非允許細胞，包括 Hela(人宮頸癌細胞)、2BS(人胚肺二倍體成纖維細胞)、143TK-(人骨髓瘤細胞)、Hep-2(人喉癌細胞)、HEL(人新生兒腎細胞)以及JT-1(人類淋巴母細胞)等[4-5,7]。其中 Hela 是痘苗病毒非復制機制的研究中的模式細胞。

1 材料與方法

1.1材料VTT、NTV由本科室保存。痘苗病毒兔源多抗血清和痘苗病毒A27蛋白鼠多抗血清由本科室保存，分別命名為anti-VTT polyclonal antisera、anti-A27 polyclonal antisera。Anti-his tag antibody購自康為世紀生物科技公司；Anti-β-actin antibody 購自cell Signaling公司；山羊抗兔IgG/辣根酶標記、山羊抗鼠IgG/辣根酶標購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；DyLight700山羊抗兔/800山羊抗鼠紅外二抗購自Li-COR公司。

1.2VTT和NTV病毒擴增、純化及滴度測定

1.2.1 VTT、NTV的擴增:常規(guī)方法制備雞胚成纖維細胞(CEF)，將VTT或NTV 以0.01 MOI感染CEF細胞，其中VTT于37 ℃擴增培養(yǎng)，NTV于33 ℃擴增培養(yǎng)，培養(yǎng)至完全病變，收集細胞。

1.2.2 VTT、NTV的純化:將上述細胞病毒液超聲破碎與胰酶按體積比4∶1混合，37 ℃水浴30 min，期間震蕩2次；離心RCF741 g，rad10.6 cm，10 min，上清移至新的離心管，10 mmol/L Tris-HCl, pH 10洗沉淀3次，離心所得上清混合；向超速離心管中加入冷的36%蔗糖18 ml，將病毒液上清緩慢加入到離心管上相，用10 mmol/L Tris-HCl 調(diào)節(jié)平衡；離心RCF21 900 g，rad10.7 cm，90 min；棄上清，沉淀用適量的PBS重懸，移至凍存管-80 ℃保存。

1.2.3 免疫染色法測定病毒滴度:6孔板過夜培養(yǎng)BHK-21細胞至單層；用含2% FBS的DMEM維持培養(yǎng)基將病毒10倍梯度稀釋感染細胞，每個稀釋梯度2復孔，培養(yǎng)箱中吸附培養(yǎng)2 h換成維持培養(yǎng)基培養(yǎng)；24 h后移除培養(yǎng)基，細胞用PBS洗2遍，每孔加入1 ml的丙酮/甲醇(1∶1)固定2 min；PBS洗3次；兔抗痘苗病毒抗體用含3%FBS的PBS稀釋，37 ℃混合孵育1 h；PBS洗5次，羊抗兔IgG二抗用上述稀釋液按1∶500稀釋，37 ℃混合孵育45 min；PBS洗5次，用DAB作為HRP的底物顯色；觀察并記錄病毒斑個數(shù)，計算病毒滴度。

1.3痘苗病毒早期蛋白E3、晚期蛋白F17鼠多抗血清制備

1.3.1 基因合成和原核表達載體構(gòu)建:通過PCR從痘苗病毒基因組上獲取f17r、e3l基因序列，測序并優(yōu)化密碼子基因合成，在基因尾部加6個組氨酸編碼序列，編碼框兩端分別插入酶切位點BamHI和NdeI。將整個編碼框序列克隆到pET9a原核表達載體上，命名為pET9a-F17R、pET9a-E3L，對兩個質(zhì)粒作酶切及測序鑒定。

1.3.2 蛋白的表達及鑒定:將鑒定陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3)，挑選單克隆優(yōu)化表達離心收獲菌體制備樣品，作SDS-PAGE電泳分析。以Anti-his tag antibody作為一抗作Western blot鑒定。

1.3.3 蛋白的純化及鑒定:E3蛋白的菌種1:50接種于含50 mg/L 卡那霉素的LB 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600=0.8 時加入終濃度為1 mmol/L 的IPTG 于37 ℃誘導表達2 h。菌體用pH7.0含 20 mmol/L 磷酸鹽、300 mmol/L NaCl緩沖液重懸，冰水浴超聲破碎菌體，功率為300 W，超聲4 s，間隔8 s，共60次，4 ℃離心RCF17 300 g，rad10.7 cm，20 min。上清和沉淀分別經(jīng)SDS-PAGE電泳分析蛋白在上述緩沖液中的水溶性。菌液上清經(jīng)His-Bind親和層析純化，用不同濃度的咪唑洗脫液洗脫蛋白。

F17蛋白為25 ℃過夜誘導表達，收獲菌體方法同E3。用pH=5.8含20 mmol/L 磷酸鹽、300 mmol/L NaCl、0.1%Triton緩沖液洗包涵體1次。再用pH=8.0 含20 mmol/L 磷酸鹽300 mmol/L NaCl、2 mol/L尿素的緩沖液懸起冰水浴超聲，功率200 w，超聲4 s，間隔8 s，共25次，4 ℃離心RCF17 300 g，rad10.7 cm，20 min，上清純化同E3蛋白。

1.3.4 免疫小鼠及多抗血清效價測定:純化蛋白的濃度測定，方法參照BCA蛋白濃度測定試劑盒使用說明。選擇6～8周齡雌性BALB/c小鼠，于第1、12和24天采用皮下多點注射免疫小鼠。首次免疫E3或F17與完全弗氏佐劑1∶1乳化，皮下多點免疫，劑量為100 μg/只。第二、三次免疫將蛋白與不完全弗氏佐劑1∶1乳化，劑量同上，同時設PBS對照。第36天取小鼠血清，ELISA 方法進行效價測定。

1.4早晚期蛋白表達水平鑒定選擇NTV非允許細胞Hela進行痘苗早、晚期蛋白表達研究，同時以VTT為檢測陽性對照。6孔板培養(yǎng)細胞生長至匯片，VTT、NTV 分別以5 MOI感染Hela 細胞，37 ℃吸附1 h，吸出病毒液，換成含2%FBS的DMEM培養(yǎng)，分別于感染后2 h、4 h、8 h、16 h去除細胞培養(yǎng)液，用冰冷的PBS洗細胞面2遍；加入細胞裂解液裂解并收集細胞，離心RCF2 152 g，rad7.7 cm，2 min。上清轉(zhuǎn)移至新的潔凈的EP管，加入20 μl 5×SDS Loading Buffer，沸水浴5 min，保存于-80 ℃?zhèn)溆?。感染的細胞樣品SDS-PAGE電泳后，用Western blot方法對病毒的E3、A27和F17蛋白表達情況進行鑒定，并以β-Actin作為內(nèi)參指數(shù)。

2 結(jié)果

2.1病毒兩株病毒得到成功的擴增和純化，經(jīng)蔗糖墊層純化的VTT滴度為5×108PFU/ml，NTV滴度為2×108PFU/ml。

2.2E3L、F17R蛋白表達質(zhì)粒酶切鑒定重組載體pET9a-E3L和pET9a-F17R分別用BamHI和NdeI酶切并送測序，結(jié)果顯示E3L和F17R基因正確插入載體pET9a中。

2.3蛋白的誘導表達及鑒定將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 菌株進行蛋白表達，經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖1所示。Anti-his tag antibody作Western blot對目的蛋白進行特異性鑒定，在預期位置有特異性反應條帶。說明E3、F17蛋白在大腸桿菌中均獲得了高效表達，占菌體蛋白總量10%以上。

2.4蛋白的純化E3蛋白表達菌體在pH7.0緩沖液中超聲離心后，菌體上清SDS-PAGE膠分析，結(jié)果如圖2A-1所示，蛋白表現(xiàn)出較高的水溶性。F17在上述pH7.0緩沖液中形成包涵體，而在pH=5.8含2 mol/L尿素緩沖液中溶解量極高，如圖2B-1。

將上述E3蛋白菌體上清和F17包涵體上清經(jīng)His-Bind親和層析純化。依次用100 mmol/L、300 mmol/L、500 mmol/L咪唑洗脫液洗脫蛋白。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，如圖2所示，100 mmol/L咪唑能洗脫雜蛋白，E3和F17蛋白皆是300 mmol/L咪唑洗脫。目的蛋白用Millipore超濾離心管濃縮，用Image Lab 軟件對濃縮蛋白純度分析，純度均達90%。

2.5E3和F17蛋白多抗血清的制備及抗體效價測定選擇弗氏佐劑與蛋白抗原乳化后，免疫小鼠制備多抗血清。經(jīng)ELISA檢測E3和F17的鼠多抗血清滴度均大于1:12 800，在Western blot 檢測中E3和F17的鼠多抗血清使用稀釋度分別為1∶500、1∶1 000。

2.6NTV在非允許細胞Hela中晚期蛋白表達水平鑒定結(jié)果如圖3所示，在VTT感染Hela細胞中，早期蛋白E3和晚期蛋白A27、F17分別在感染后2 h和4 h即可檢出，與早期研究結(jié)果相符[8]。 從圖上可看出NTV早期蛋白E3的反應強度與VTT相近，說明NTV E3蛋白可正常表達。與VTT比，晚期蛋白A27在NTV中的表達也是正常的；而F17在預期位置僅可檢測到微弱的表達，說明F17蛋白表達量較低。

M：marker；1：空載體；2：E3L蛋白全菌裂解液；3：F17R蛋白全菌裂解液圖1 E3L和F17R蛋白原核表達的SDS-PAGE分析(A)及Western blot 鑒定(B)M:marker; 1：E. coli lysate of empty plasmid vector；2：E. coli lysate of E3L；3：E. coli lysate of F17R Fig.1 SDS-PAGE(A) and Western blot(B) analysis of protein E3L and F17R prokaryotic expression

M：marker；A-1：E3蛋白菌體上清；B-1：F17蛋白包涵體； 2∶100 mmol/L咪唑洗脫液；3∶300 mmol/L咪唑洗脫液；4∶500 mmol/L咪唑洗脫液圖2 E3(A)和F17(B)蛋白純化的SDS-PAGE分析M：marker； A-1：supernatant of E3-protein E. coli lysate；B-1：supernatant of F17-protein inclusion body lysate；2∶100 mmol/L imidazole eluent；3∶300 mmol/L imidazole eluent；4∶500 mmol/L imidazole eluentFig.2 SDS-PAGE analysis of protein E3(A) and F17(B) purification

圖3 NTV 在Hela細胞中早晚期蛋白表達的Western blot鑒定Fig.3 Western blot analysis of early and late protein expression in NTV infected Hela cells

3 討論

痘苗病毒形態(tài)發(fā)生過程產(chǎn)生5種不同類型的病毒粒子：未成熟病毒粒子(immature virion, IV)，具有感染性的胞內(nèi)成熟病毒粒子(intracellular mature virion, MV)，胞內(nèi)包膜病毒粒子(intracellular enveloped virion, WV)，結(jié)合型包膜病毒粒子(cell-associated enveloped virion, CEV)和胞外包膜病毒粒子(extracellular enveloped virion, EV)。痘苗病毒基因組的表達與復制存在著嚴格的時序性，不同的基因在病毒生命周期的不同階段表達，調(diào)節(jié)著病毒的形態(tài)發(fā)生和與宿主之間的相互作用。由于3株復制缺陷病毒MVA、NYVAC和NTV自然或人為缺失基因不盡相同，病毒基本的生物學特征和復制缺陷機制也存在差異。目前國際上針對MVA和NYVAC的體外生物學特征及非復制機制已經(jīng)研究得非常清楚：MVA是由于病毒粒子包裝受阻[6-7]，而NYVAC是由于晚期蛋白翻譯水平被抑制所致[8]。但NTV具體在復制周期的哪一步被阻斷尚不清楚。本研究將3株病毒對比，發(fā)現(xiàn)NTV病毒基因改造方式和缺失的基因序列與NYVAC更加接近，因此推測NTV的復制缺陷機制可能與NYVAC類似。而目前報導的常用在痘苗病毒非復制機制研究中的蛋白有早期蛋白K3、E3[4,7-10]和晚期蛋白A17、A27、A14、F17[11-13]。本研究選擇了與痘苗病毒復制和形態(tài)發(fā)生密切相關(guān)的早期蛋白E3、晚期蛋白A27和F17制備了鼠多抗血清對NTV在Hela細胞中蛋白表達水平進行鑒定。

E3蛋白是痘苗病毒基因編碼相對分子質(zhì)量為22×103蛋白，在C末端和N末端各有一個高度保守的結(jié)構(gòu)域可以與zDNA結(jié)合域和N末端為雙鏈RNA結(jié)合域(dsRBM)結(jié)合。E3L通過與zDNA和dsRBM結(jié)合，具有抵御宿主細胞干擾素及抑制PKR活性的作用，影響病毒的宿主范圍和細胞凋亡相關(guān)特性[14]。A27是病毒的晚期蛋白，存在于IMV表面，是病毒顆粒的運輸和包裝必需的，抑制A27 L基因表達會阻斷IMV運輸，抑制IEV顆粒的形成。A27 L蛋白還與另外兩種IMV蛋白A17 L和A14 L形成復合物，促進細胞間的融合[13]。F17是p11啟動子下的蛋白，相對分子質(zhì)量約為11×103,在早期的文獻中又被稱作F18蛋白或也p11，是一種重要的結(jié)構(gòu)蛋白，據(jù)估計占了病毒粒子質(zhì)量的11%。F17可以與A27、A14形成復合物對病毒粒子的形態(tài)發(fā)生和成熟具有至關(guān)重要的作用，抑制F17的表達會破壞病毒粒子的形態(tài)形成，導致空的、異常的IV及異常的球形IMV的積累[12,15]。

本研究通過大腸桿菌表達系統(tǒng)獲得了痘苗病毒天壇株的功能相關(guān)蛋白E3和F17R，并制備了相應鼠多抗血清，為初步探索NTV的復制缺陷機制提供了一定的物質(zhì)基礎。在人源細胞Hela中NTV早期蛋白E3和晚期蛋白A27均能正常表達，而晚期蛋白F17僅可檢測到微弱的表達，表明F17蛋白表達受到抑制。由于F17對病毒顆粒的結(jié)構(gòu)組成和形態(tài)發(fā)生均起著重要作用，此蛋白表達受限會阻斷感染性病毒粒子的形成，是NTV復制缺陷的機制之一。而NYVAC的復制缺陷是晚期蛋白A27表達受阻，NTV和NYVAC的復制缺陷機制都與晚期蛋白表達受阻有關(guān)，但相應的晚期蛋白有所不同。我們將對其他的復制相關(guān)晚期蛋白，如A14、A17的表達水平以及NTV細胞凋亡抑制基因進行研究，進一步探究NTV的復制缺陷機制。

利益沖突:無

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