宋 君，葉先林，尹 全，張富麗，王 東，李 潔

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 分析測試中心，四川 成都 610066；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)村經(jīng)濟與農(nóng)業(yè)信息研究所，四川 成都 610066)

與抗常見的草甘膦或草丁膦類除草劑轉(zhuǎn)基因作物不一樣，轉(zhuǎn)基因玉米DAS-4-40278-9是一種抗吲哚乙酸衍生物(生長激素)——苯氧基羧酸類除草劑的轉(zhuǎn)基因作物。DAS-4-40278-9玉米(商品名為EnlistTMMaize)由陶氏農(nóng)業(yè)科學(xué)公司(DOW AgroSciences LLC)研發(fā)，2011年美國、澳大利亞、新西蘭、墨西哥和中國臺灣率先批準使用該玉米品系作為食品和飼料的生產(chǎn)、加工原材料。目前，該轉(zhuǎn)基因玉米品系的商業(yè)化種植時間較短。2012年加拿大首次在本國進行商業(yè)化種植該品系，美國和巴西分別在2014和2015年開始商業(yè)化種植DAS-4-40278-9玉米[1]。截至目前，我國尚未批準轉(zhuǎn)基因玉米DAS-4-40278-9進口。轉(zhuǎn)基因玉米DAS-4-40278-9轉(zhuǎn)化體的抗除草劑目的基因aad-1由來自玉米本身的啟動子ZmPer3’UTR和終止子ZmUbi1調(diào)控。本實驗室根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米DAS-4-40278-9品系的外源基因與受體基因組間的旁側(cè)序列設(shè)計了一對特異引物和探針，在優(yōu)化PCR反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上，建立了轉(zhuǎn)基因玉米DAS-4-40278-9的實時熒光定量PCR檢測方法，并驗證和確認方法的特異性、靈敏度和準確度都達到歐盟轉(zhuǎn)基因生物檢測技術(shù)的要求[2-3]。

為了評估檢測結(jié)果的質(zhì)量、可靠性以及數(shù)據(jù)的可比較性，《檢驗檢測機構(gòu)資質(zhì)認定評審準則》[4]要求實驗室在特定情況下，在出具檢測結(jié)果的同時給出檢測結(jié)果的不確定度。轉(zhuǎn)基因生物及成分的定量檢測方法是隨著20世紀末實時熒光定量PCR技術(shù)的發(fā)明和化學(xué)基團標記技術(shù)在寡核苷酸上的廣泛應(yīng)用的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種基因定量測量技術(shù)。由于轉(zhuǎn)基因生物定量測量步驟繁多、所有反應(yīng)都集中在20～100 μL內(nèi)的試管中進行。因此，轉(zhuǎn)基因成分的定量操作都是微量操作。微小的“誤差”或“失誤”經(jīng)過聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)都會被“放大”若干倍，導(dǎo)致結(jié)果產(chǎn)生極大的不確定度，但是目前不確定度在轉(zhuǎn)基因成分定量檢測中的應(yīng)用卻少有報道[5-6]。大多數(shù)從事轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品的試驗人員對不確定度知識及其評定了解甚少[7]，而關(guān)于蒙特卡洛法(Monte Carlo Method，MCM)評定轉(zhuǎn)基因生物成分的測量不確定度在國際上鮮見報道。

MCM是一種根據(jù)實驗室測量的各輸入量的概率分布，模擬抽取“海量”樣本(每個輸入量在95%包含概率下的抽樣量為106次)、將海量樣本按照設(shè)定的概率分布通過建立的數(shù)學(xué)測量模型傳遞、計算獲得檢測結(jié)果(輸出量)的不確定度及包含區(qū)間的數(shù)值計算方法。MCM的實施必須在計算機的輔助下才能完成。為了避免計算復(fù)雜的偏導(dǎo)數(shù)(靈敏度系數(shù))以及判斷轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品測量是否滿足“正態(tài)分布假設(shè)”的困惑，本實驗利用MCM來評定轉(zhuǎn)基因玉米DAS-4-40278-9的測量不確定度，研究新方法在轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品測量不確定度評定中的應(yīng)用，為轉(zhuǎn)基因成分測量不確定度評定提供適合的方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

用含量為10%的轉(zhuǎn)基因玉米DAS-4-40278-9的基因組DNA的系列稀釋溶液(5個濃度點)作為定量PCR儀的校準子(Calibrator)校準儀器(擬合校準曲線)。以含量為1%的轉(zhuǎn)基因玉米DAS-4-40278-9標準品作為待測樣品；DNA的分離與純化采用北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)的高效植物基因組DNA提取試劑盒；實時PCR試劑購自Toyobo公司(Osaka，Japan)生產(chǎn)的THUNDERBIRDTMProbe qPCR試劑盒；試驗中用到的引物/探針按照本實驗室報道的方法合成[2](上海生工合成和標記)；分光光度計(Nanodrop-1000，Thermo，USA)和定量PCR儀(7500，ABI，USA)是本研究中用到的主要儀器設(shè)備，分別用于檢測提取到的DNA的質(zhì)量，擴增和定量檢測玉米內(nèi)源基因(zSSIIb)、轉(zhuǎn)基因玉米DAS-4-40278-9片段。

1.2 測量方法

標準物質(zhì)和試樣DNA的分離和純化，按照試劑盒說明書操作。

將提取到的標準物質(zhì)DNA稀釋成92.0、23.0、6.0、1.5、0.4 ng·μL-1。根據(jù)玉米基因組大小[8]估算，上述DNA溶液分別相當于每μL含1.7×106、4.0×105、1.0×105、2.5×104、6.3×103拷貝DNA分子。取3 μL上述系列標準物質(zhì)DNA溶液作為20 μL PCR體系的擴增模板。PCR體系含2×Master MIX、上/下游引物(擴增玉米內(nèi)源基因zSSIIb和DAS-4-40278-9片段)各0.5 μmol·μL-1、探針0.25 μmol·μL-1。PCR反應(yīng)程序為95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min(40個循環(huán))。上述系列標準物質(zhì)DNA溶液濃度點做3個平行擴增反應(yīng)。5個濃度點的標準物質(zhì)DNA的量及其PCR儀的響應(yīng)值(threshold of cycles，Ct)作為PCR儀的校準子(calibrators)，分別擬合zSSIIb和DAS-4-40278-9片段的校準曲線。

取待測樣品的DNA約50～100 ng作為模板，分別擴增待測樣品的玉米內(nèi)源基因zSSIIb和DAS-4-40278-9片段，PCR體系和反應(yīng)程序同上。待測樣品重復(fù)測量24次。

2 結(jié)果與分析

2.1 測量模型

轉(zhuǎn)基因成分定量檢測的原理是利用一系列標準物質(zhì)DNA作為PCR模板，通過內(nèi)、外源基因的擴增反應(yīng)，建立內(nèi)/外源基因的校準曲線，然后將測試樣品的內(nèi)/外源基因的Ct值(PCR反應(yīng)的儀器檢測值)代入內(nèi)/外源基因的校準曲線，獲得測試樣品的內(nèi)/外源基因的絕對含量，再通過外源基因絕對含量與內(nèi)源基因絕對含量的比值，計算得到測試樣品中外源基因的相對含量。本文按照文獻[7]建立測量模型。

2.2 MCM不確定度評定

根據(jù)GUM Supp1，MCM不確定度評定是利用對概率分布進行隨機抽樣進行分布傳播的方法，通過建立的數(shù)學(xué)測量模型定義輸出量(測試樣品中轉(zhuǎn)基因玉米DAS-4-40278-9的相對百分含量C)，利用MATLAB軟件實施MCM的輸入(確定各輸入量并設(shè)定輸入量的概率分布函數(shù)(probability distribution function，PDF)、選擇MCM試驗樣本量的大小M)、MCM的傳播(從輸入量的PDF中抽取M個樣本值、對輸入量的樣本矢量計算相應(yīng)輸出量的模型值)和MCM的輸出(計算獲得輸出量的平均值、標準不確定度和特定包含概率下的包含區(qū)間)。

2.2.1 MCM輸入

系列標準物質(zhì)DNA的已知量及其響應(yīng)值(Cti)(表1和表2)和測試樣品的內(nèi)/外源基因的Ct值(表3)作為輸入量。Cti和Ct遵循均勻分布R(a，b)(a為均勻分布的下限，b均勻分布的上限)，構(gòu)建ξ=a+(b-a)r(ξ為任意值，r為從標準均勻分布中抽取的隨機數(shù))，從均勻分布中抽取106個樣本。測試樣品的內(nèi)/外源基因的絕對含量(A)作為輸入量，設(shè)定為正態(tài)分布N(y，u2(y))(y為最佳估計值，u(y)為標準不確定度)，從標準正態(tài)分布N(0，1)中抽取隨機數(shù)r，對任意值ξ，構(gòu)造ξ=y+u(y)r。

表1 zSSIIb內(nèi)源基因校準曲線擬合Table 1 Fitting of calibration curve for endogenous gene zSSIIb

表2 DAS-4-40278-9片段校準曲線擬合Table 2 Fitting of calibration curve for the flanking fragments of DAS-4-40278-9 line

表3 試樣中內(nèi)源基因zSSIIb和DAS-4-40278-9片段的Ct值Table 3 Ct values for endogenous gene zSSIIb and the flanking fragments of DAS-4-40278-9 line in the testing sample

2.2.2 MCM傳播和輸出

從輸入量Cti的PDF(均勻分布)中抽取M=106個樣本值，計算獲得內(nèi)/外源基因校準曲線的斜率m和截距k。由于m和k是兩個相關(guān)聯(lián)的輸出量，二者的PDF為雙元正態(tài)聯(lián)合(聯(lián)合正態(tài)分布)，所以在MCM傳播過程中按JCGM 102∶2011[9]計算m和k。各輸入量的分布類型、均值和包含區(qū)間見表4。類似地，從測試樣品的內(nèi)/外源基因Ct值的均勻分布中抽取106個樣本量，計算獲得內(nèi)/外源基因絕對含量的PDF和平均值。從測試樣品的內(nèi)/外源基因絕對量的正態(tài)分布中抽取106個樣本，獲得輸出量DAS-4-40278-9分子片段的相對含量C的PDF、平均值、標準不確定度以及包含區(qū)間。

3 結(jié)論

測試樣品中轉(zhuǎn)基因玉米DAS-4-40278-9的相對含量的平均值為1%，與理論含量一致，不確定度非常小(3.07×10-4)。轉(zhuǎn)基因玉米DAS-4-40278-9相對含量的測量值在95%的概率下落在極小的分布范圍0.94%～1.06%內(nèi)，充分顯示本次試驗的測量質(zhì)量高，數(shù)據(jù)可靠。MATLAB程序運行產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因玉米DAS-4-40278-9相對含量的概率分布為正態(tài)分布。

表4 各輸入/輸出量的分布及不確定度和95%置信度的包含區(qū)間Table 4 The probability distribution for all the input and output quantities and their 95% coverage intervals

續(xù)表4

續(xù)表4

Ct11～Ct53(統(tǒng)稱Cti)表示zSSIIb基因測量中標準物質(zhì)各濃度點的響應(yīng)值；Ct11#～Ct53#(統(tǒng)稱Cti#)表示40278測量中標準物質(zhì)各濃度點的響應(yīng)值；Ct_S1～Ct_S24(統(tǒng)稱Ct_Si)表示試樣24次重復(fù)測量zSSIIb基因獲得的Ct值；Ct_S1#～Ct_S24#(統(tǒng)稱Ct_Si#)表示試樣24次重復(fù)測量40278片段獲得的Ct值；Q_zSSIIb表示試樣中zSSIIb的絕對含量；Q_40278表示試樣中40278片段的絕對含量；C表示試樣中40278片段的相對含量；mzSSIIb和m40278分別為zSSIIb基因和40278片段的校準曲線的斜率；kzSSIIb和k40278分別為zSSIIb基因和40278片段的校準曲線的截距。
Ct11～Ct53(Cti) represents the instrument response of theithcalibrator used as the DNA template for PCR ofzSSIIbgene；Ct11#～Ct53#(Cti#) represents the instrument response of theithcalibrator used as the DNA template for PCR of 40278；Ct_S1～Ct_S24(Ct_Si) represents theithCtvalues forzSSIIbgene in the test sample；Ct_S1#～Ct_S24#(Ct_Si#) represents theithCtvalues for 40278 fragments in the test sample；Q_zSSIIbrepresents the absolute content forzSSIIbgene in the test sample；Q_40278 represents the absolute content for 40278 fragments in the test sample；Crepresents the measurand the relative content of 40278 fragments in the test sample；mzSSIIbandm40278represent slopes of calibration curves forzSSIIband 40278 fragments，respectively；kzSSIIbandk40278represent intercepts of calibration curves forzSSIIband 40278 fragments，respectively.

圖1 DAS-4-40278-9片段相對含量的概率分布Fig.1 Probability distribution for the relative content of DAS-4-40278-9 fragments in the test sample

在所有輸入/出量的不確定度中，玉米內(nèi)源基因zSSIIb絕對定量的不確定度最大，達到7.25 ng，這與樣品中細胞的裂解率、DNA的提取率和PCR模板的擴增率不一致有關(guān)。因此，采用絕對定量來表征轉(zhuǎn)基因成分的含量是極不科學(xué)的。轉(zhuǎn)基因成分的含量一般用相對含量表達，通過采用外源基因絕對含量除以內(nèi)源基因絕對含量來降低細胞裂解率、DNA提取率和DNA模板擴增率不一致導(dǎo)致的測量結(jié)果偏差。除內(nèi)源基因zSSIIb絕對定量的不確定度外，DNA溶液的系列梯度稀釋中的6.0 ng·μL-1濃度點的稀釋產(chǎn)生的不確定度達到0.28(Ct31～Ct33)，0.4 ng·μL-1DNA溶液的稀釋產(chǎn)生的不確定度為0.21(Ct51～Ct53)，23 ng·μL-1DNA溶液的稀釋產(chǎn)生的不確定度為0.19(Ct21～Ct23)。這在所有不確定度中具有相對較大的貢獻，因此是影響轉(zhuǎn)基因成分測量的主要因素。在解決如何提高轉(zhuǎn)基因成分檢測質(zhì)量時，應(yīng)重點考慮提高參考物質(zhì)DNA溶液濃度的稀釋的準確度，降低其不確定度。

本實驗在MATLAB軟件的基礎(chǔ)上編寫了“概率分布傳播”的計算機程序代碼，應(yīng)用MCM法評定了轉(zhuǎn)基因成分的測量不確定度。與傳統(tǒng)的GUM法相比，MCM法完全采用計算機程序輔助，避免了采用GUM法需要手動計算復(fù)雜的各輸入量的靈敏度系數(shù)的偏導(dǎo)數(shù)。同時，MCM法獲得的不確定度評定結(jié)果的概率分布可能是正態(tài)分布或其他分布，因此在使用MCM法時無需再考慮輸入量的對稱性和遵守輸出量正態(tài)分布的假設(shè)。實踐中，為了獲得可靠的不確定度評定結(jié)果，研究人員往往還要使用MCM法對GUM法的評定結(jié)果進行驗證，建議在開展轉(zhuǎn)基因成分測量不確定度評定時應(yīng)盡量采用MCM法。

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