王桂躍，蘇 婷，韓海亮，譚禾平，包 斐，趙福成

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 東陽玉米研究所，浙江 東陽 322100)

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，參與土壤中幾乎一切生物化學(xué)反應(yīng)，對維持土壤生態(tài)平衡具有重要作用[1]。微生物群落對環(huán)境條件的變化反應(yīng)敏捷，因而常被作為生態(tài)風(fēng)險評估的敏感性生物指標(biāo)之一[2]。土壤微生物生物量既是土壤有機質(zhì)和土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化與循環(huán)的動力，又可作為土壤中植物有效養(yǎng)分的儲備庫，對土壤環(huán)境因子的變化極為敏感，土壤的微小變動均會引起其活性變化[3]。土壤微生物生物量的主要組成包括微生物量碳(microbial biomass carbon，MBC)和微生物量氮(microbial biomass nitrogen，MBN)。溶解性有機碳(dissolved organic carbon，DOC)和溶解性有機氮(dissolved organic nitrogen，DON)是土壤溶解性有機質(zhì)的2個重要組成部分。MBC、MBN、DOC和DON是對土壤質(zhì)量變化響應(yīng)最明顯和最迅速的土壤活性組成部分[4]。土壤酶是土壤物質(zhì)循環(huán)和能量流動的重要參與者，是土壤有機體的代謝動力，在土壤生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用[5]。因此，土壤微生物群落、活性碳氮含量，以及土壤酶活性常被用來評價土壤的生物學(xué)性狀。

施肥是影響土壤質(zhì)量演化及其可持續(xù)利用最為深刻的農(nóng)業(yè)措施之一[3]，它通過改變土壤微生物活性、數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)，從而改變土壤C、N養(yǎng)分轉(zhuǎn)化速率和途徑，影響土壤供氮能力和碳儲備能力，進而影響土壤質(zhì)量。有關(guān)施肥對土壤物理、化學(xué)性質(zhì)及環(huán)境的影響，已有大量研究[6]，但涉及土壤生物學(xué)特性的研究較少。近20年來，土壤生物學(xué)特性在土壤肥力研究中的地位顯著加強。前人研究認(rèn)為，施用有機肥料可以顯著提高土壤微生物量碳、氮的含量，以及土壤酶活性，并且隨著用量的增大，效果也隨之增強[7-8]。另有研究表明，施用化學(xué)肥料也能提高土壤微生物量碳的含量[9]。但是，王繼紅等[10]研究表明，過量施用化肥會使土壤微生物量碳的含量降低，而適量施用氮肥或磷肥均能夠使土壤中微生物生物量碳、氮含量增加[11]。路磊等[12]研究也表明，單施化肥使土壤中的微生物生物量氮的含量降低，王俊華等[13]和卜洪震等[14]長期施肥研究結(jié)果表明，與單施化肥相比，有機肥與化肥配合施用條件下土壤中微生物生物量碳的含量提高更顯著。然而，迄今在該領(lǐng)域的研究大多集中在單一施用化肥或有機肥對少數(shù)土壤微生物學(xué)指標(biāo)的影響上，關(guān)于長期測土配方施肥下土壤微生物群落、微生物量，以及土壤酶活性等多種土壤生物學(xué)指標(biāo)的變化，尚缺少相關(guān)研究。

本研究在浙江省東陽玉米研究所定位監(jiān)測基地通過6 a的測土配方試驗，旨在了解長期施肥對水田和旱地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、活性碳氮含量及酶活性的影響，以期為科學(xué)施肥、保護和合理利用現(xiàn)有耕地資源提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤與試驗設(shè)計

定位試驗于2009年開始，在浙江省東陽玉米研究所基地內(nèi)進行，土壤為黃紅壤，0～20 cm土層土壤基本理化性狀：有機質(zhì)13.8 g·kg-1，全氮 0.50 g·kg-1，全磷0.42 g·kg-1，全鉀1.54 g·kg-1，速效氮 21.6 mg·kg-1，有效磷 3.25 mg·kg-1，速效鉀 20.3 mg·kg-1，pH值5.42。試驗共設(shè)6個處理：①PCK，水田無肥區(qū)，不施用任何肥料；②PCF，水田常規(guī)施肥區(qū)，按當(dāng)?shù)刂饕┓柿?N，210 kg·hm-2；P2O5，60 kg·hm-2；K2O，70 kg·hm-2)及化學(xué)肥料品種(尿素、過磷酸鈣、氯化鉀)施肥；③PSTF，水田測土配方施肥純化肥區(qū)，根據(jù)土壤養(yǎng)分情況和作物確定最佳施肥量(N，225 kg·hm-2；P2O5，85 kg·hm-2；K2O，120 kg·hm-2)，肥料品種同PCF；④PSTF+OF，水田測土配方施肥化肥+有機肥區(qū)，在PSTF的基礎(chǔ)上增施商品精致有機肥(有機質(zhì)含量45%，N 1.8%+P2O51.6%+K2O 2.2%)22 500 kg·hm-2；⑤DCF，旱地常規(guī)施肥區(qū)，N、P2O5、K2O投入量分別為275、60、175 kg·hm-2，肥料分別選用尿素、鈣鎂磷肥和氯化鉀；⑥D(zhuǎn)STF+OF，旱地測土配方施肥化肥+有機肥區(qū)，N、P2O5、K2O投入量分別為240、72、140 kg·hm-2，肥料品種同DCF，此外再施用商品精致有機肥(有機質(zhì)含量45%，N 1.8%+P2O51.6%+K2O 2.2%)22 500 kg·hm-2。各處理除施肥不同外，其他土壤與作物管理措施均保持一致。

各處理小區(qū)面積33.3 m2，水田小區(qū)間用水泥板隔開，防止肥、水互相滲透。水泥板高60 cm、厚5 cm，埋深30 cm，露出田面30 cm。每小區(qū)各有一進水口和一出水口，進水口位置高于出水口，安裝閥門。旱地小區(qū)以排水溝和水泥板相隔，水泥板厚度5 cm，埋深40 cm，高出畦面20 cm。水田種植一年一季晚稻甬優(yōu)9號，旱地常年種植春夏兩季玉米，品種均為渝糯7號。

1.2 土壤樣品采集

土壤樣品采集于2015年3月底。每小區(qū)按S形取樣法5點取樣，取0～20 cm層土壤，均勻混合。土樣帶回室內(nèi)揀去石礫和植物殘體等，過2 mm土篩，分成3份：一份風(fēng)干后，用于測定土壤理化性狀和土壤酶活性；第二份立即保存于4 ℃冰箱中，用于土壤微生物量碳、氮的測定；第三份土樣保存于-70 ℃冰箱，用于土壤磷脂脂肪酸(PLFA)的測定。

1.3 樣品分析方法

土壤化學(xué)性質(zhì)測定參照文獻[15]：土壤有機質(zhì)采用重鉻酸鉀氧化法；土壤全氮采用半微量開氏法；全碳采用重鉻酸鉀容量法；土壤有效磷采用碳酸氫鈉(Olsen)法；土壤速效鉀采用乙酸銨提取火焰分光光度法；土壤pH采用1∶2.5土水質(zhì)量體積比浸提，用pH計測定。

土壤可培養(yǎng)細菌、真菌和放線菌種群數(shù)量的測定分別采用牛肉膏蛋白胨、孟加拉紅和改良高氏一號培養(yǎng)基平板稀釋法[16]，平板計數(shù)；PLFA的提取與純化參考Eli等[17]和吳愉萍[18]的方法進行，不同磷脂脂肪酸的種類和含量表示不同微生物的種類和生物量，以12∶0、14∶0、15∶0、16∶0、17∶0、18∶0、20∶0、i15∶0、i17∶0、a15∶0、a17∶0、cy17∶0、cy19∶0表示細菌生物量[14-16]，以18∶2ω6、18∶3ω6、18∶1ω9表示真菌生物量[19-22]，以16∶0 10Me、17∶0 10Me、18∶0 10Me表示放線菌生物量[23]；土壤MBC、MBN采用氯仿熏蒸浸提方法測定(轉(zhuǎn)換系數(shù)分別取0.38和0.54)[24]；使用流動注射分析儀測定銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量；DOC、DON含量采用KCl溶液浸提，然后使用Multi N/C 3100測定DOC、溶解性總氮(TDN)含量，TDN減去銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的剩余部分即為DON含量；土壤纖維素酶、脲酶、脫氫酶和過氧化氫酶分別采用3，5-二硝基水楊酸法、靛酚藍比色法、TTC還原法和高錳酸鉀滴定法測定[25]。

1.4 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007整理后，利用SPSS 21.0 for Windows進行統(tǒng)計分析，用ANOVA進行方差分析、LSD法進行差異顯著性檢驗(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 對土壤化學(xué)性狀的影響

從表1可以看出，與長期不施肥(PCK)相比，水田施肥可顯著(P<0.05)提高土壤有效磷和速效鉀的含量，同時能顯著(P<0.05)降低土壤pH值，但在試驗期間對土壤有機質(zhì)、全碳和全氮含量無顯著影響。水田中，與常規(guī)施肥(PCF)相比，PSTF處理的土壤化學(xué)性狀無顯著差異，而PSTF+OF處理的土壤全碳和有效磷含量顯著(P<0.05)增加。與水田相比，在相同母質(zhì)的旱地上，DSTF+OF處理的旱地土壤有機質(zhì)、全碳、全氮、有效磷和速效鉀含量比水田相應(yīng)處理(PSTF+OF)下分別增加31.18%、16.32%、83.64%、9.76%和2.23%，pH值下降15.15%。

2.2 對土壤可培養(yǎng)微生物的影響

由圖1可知，整體上各處理的可培養(yǎng)微生物數(shù)量差異不大，僅DSTF+OF處理的真菌含量顯著(P<0.05)高于其他處理。

2.3 對土壤微生物量的影響

由圖2可知，不同施肥處理對土壤細菌和真菌群落結(jié)構(gòu)有顯著(P<0.05)影響，但對放線菌無顯著影響。水田中，與長期不施肥(PCK)相比，PSTF+OF處理顯著(P<0.05)提高了土壤細菌的磷脂脂肪酸含量，但對真菌無顯著影響。與水田上的DSTF+OF處理相比，旱地上相應(yīng)的DSTF+OF處理下細菌和真菌的磷脂脂肪酸含量均顯著(P<0.05)增加。

表1 長期施肥各處理對土壤化學(xué)性狀的影響Table 1 Effects of long-term fertilization systems on soil chemical properties

同列數(shù)據(jù)后無相同小寫字母的表示差異顯著(P<0.05)。下同。
Data followed by no same letters within the same column indicated significant difference atP<0.05. The same as below.

同一類微生物上各處理間無相同小寫字母的表示差異顯著(P<0.05)。下同。Treatments marked by no same letters indicated significant difference at P<0.05 within the same microbe group. The same as below.圖1 長期施肥各處理對土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量的影響Fig.1 Effects of long-term fertilization systems on culturable microorganisms

圖2 長期施肥各處理對土壤微生物PLFA含量的影響Fig.2 Effects of long-term fertilization systems on PLFAs

2.4 對土壤活性碳氮的影響

從表2可以看出，水田中，相較PCF，PCK處理的土壤活性碳氮、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量差異不顯著，但PSTF處理顯著(P<0.05)提高了土壤微生物量碳的含量，PSTF+OF處理能同時顯著(P<0.05)增加土壤微生物碳、氮的含量。旱地中，與旱地常規(guī)施肥處理(DCF)相比，DSTF+OF處理能顯著(P<0.05)提高土壤微生物量碳、微生物量氮和硝態(tài)氮的含量，但可溶性有機碳、可溶性有機氮和銨態(tài)氮含量均無顯著差異。

2.5 對土壤酶活性的影響

由表3可知，各處理對纖維素酶活性均無顯著影響。水田中各處理間脲酶活性無顯著差異，與之相比，旱地處理(DCF與DSTF+OF)的脲酶活性顯著(P<0.05)提高。與不施肥處理(PCK)相比，水田中PCF處理的脫氫酶活性無顯著變化，但其他處理的脫氫酶活性均顯著(P<0.05)升高。與不施肥或不施有機肥的處理相比，無論是在水田還是旱地中施入有機肥的處理(PSTF+OF和DSTF+OF)的過氧化氫酶活性均顯著(P<0.05)升高。

2.6 各因素的相關(guān)性分析

相關(guān)分析顯示(表4)，微生物群落間，細菌和真菌含量呈極顯著(P<0.01)正相關(guān)，而放線菌與細菌含量呈顯著(P<0.05)負(fù)相關(guān)；土壤活性碳、氮因素間，微生物量氮與可溶性有機碳、可溶性有機氮、硝態(tài)氮存在顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)相關(guān)性，硝態(tài)氮與可溶性有機碳、可溶性有機氮分別呈顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)正相關(guān)，銨態(tài)氮與可溶性有機碳呈極顯著(P<0.01)負(fù)相關(guān)；各土壤酶活性間無顯著相關(guān)性。此外，硝態(tài)氮與微生物群落結(jié)構(gòu)存在顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.05)相關(guān)性，微生物量碳與土壤脫氫酶和過氧化氫酶呈顯著(P<0.05)正相關(guān)。

表2 長期施肥各處理對土壤活性碳氮含量的影響Table 2 Effects of long-term fertilization systems on labile organic carbon and nitrogen mg·kg-1

表3 長期施肥各處理對土壤酶活性的影響Table 3 Effects of long-term fertilization systems on enzyme activities

表4 土壤微生物菌落結(jié)構(gòu)、活性碳氮和土壤酶活性的相關(guān)分析Table 4 Correlation coefficients within microbial community structure，labile organic carbon and nitrogen and enzyme activities

*，P<0.05; **，P<0.01.

3 討論

3.1 長期施肥對土壤化學(xué)性狀的影響

長期施用有機肥或有機肥與N、P、K配合施用可提高土壤有機質(zhì)和氮磷鉀養(yǎng)分含量，改善土壤物理性狀，調(diào)節(jié)土壤C/N，促進作物和土壤微生物的生長[23]。土壤有機碳含量變化主要受到施肥的影響，同時也受到環(huán)境因素，尤其是土壤水分、氣候變化、大氣沉降等的影響[13]，本研究中僅考慮了N、P、K和有機肥對土壤化學(xué)性狀的影響。在水田中，與PSTF處理相比，PSTF+OF處理的土壤有效磷含量顯著增加，這可能是因為有機肥的施用更有利于土壤理化特性的改善和養(yǎng)分的持續(xù)供應(yīng)，促進土壤大團聚體內(nèi)微團聚體的形成，而僅施用化肥氮磷鉀對土壤大團聚體內(nèi)微團聚體形成的促進作用緩慢，且易致土壤板結(jié)。與水田相比，在相同母質(zhì)的旱地上，施肥處理提高土壤養(yǎng)分的效應(yīng)更明顯，可能與旱地化肥用量比水田高有關(guān)。

3.2 長期施肥對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

土壤微生物易受土壤營養(yǎng)狀況、pH值、質(zhì)地、溫度、水分和通氣性等條件的影響，因此，土壤的利用方式和管理措施會使土壤微生物發(fā)生變化[26]。由于土壤生態(tài)系統(tǒng)的復(fù)雜性，關(guān)于施肥究竟如何影響土壤微生物的變化問題尚缺乏共識[27]。本研究中，不同施肥條件下，水田與旱地兩種利用方式土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量差異不大，僅DSTF+OF處理的真菌含量顯著高于其他處理，這可能與培養(yǎng)方法有關(guān)。前人研究表明，運用傳統(tǒng)的選擇性培養(yǎng)基方法鑒定的微生物僅占環(huán)境總微生物的0.1%～10%，這不能完全反映土壤中微生物真實的分布情況[28]。Bardgett等[29]認(rèn)為，土壤中磷脂脂肪酸的組成可以表示土壤微生物群落的生物量和結(jié)構(gòu)，一些研究發(fā)現(xiàn)，直接從土壤中提取的磷脂脂肪酸含量可以準(zhǔn)確地反映出土壤微生物的生物量[29-32]。本研究測定了不同施肥處理下的土壤微生物PLFA含量，結(jié)果顯示，在水田中PCK、PCF與PSTF之間細菌PLFA含量的差異不顯著，只有PSTF+OF細菌PLFA含量顯著高于PCK；而旱地的DSTF+OF處理下細菌PLFA含量顯著高于水田各處理。陳曉娟等[33]研究發(fā)現(xiàn)，細菌和真菌PLFA水稻田高于旱地，而本研究結(jié)果恰好相反，而放線菌PLFA兩者無顯著差異。以上結(jié)果的不一致可能一方面是因為旱地的施肥量比水田高，另一方面也與取樣時間有關(guān)，本試驗在初春取樣，經(jīng)過較長時間的冬期后，兩類土壤的溫度、水分和通氣性均趨于相近。Schloter等[34]研究顯示，精準(zhǔn)施肥與傳統(tǒng)施肥相比，對表層土壤的細菌和真菌群落結(jié)構(gòu)并無明顯影響，本研究亦得到類似的結(jié)果，即水田測土配方施肥(PSTF)和常規(guī)施肥處理間細菌、真菌、放線菌含量均無顯著差異。

3.3 長期施肥對土壤活性碳氮的影響

土壤微生物量碳能反映土壤有效養(yǎng)分狀況和生物活性[35]，微生物量氮是土壤氮素的一個重要儲備庫，了解土壤微生物量氮的消長有助于揭示進入土壤肥料氮素的生物固定和釋放的本質(zhì)[36-37]。對于農(nóng)田土壤，不同施肥管理對土壤微生物生物量有明顯的影響，與不施肥處理土壤相比，施肥可顯著提高土壤的微生物量碳氮的含量，其中化肥與有機肥長期配施的效果最為明顯[3]。本研究結(jié)果也證明，與不施肥處理土壤相比，PSTF+OF處理能同時增加微生物量碳和微生物量氮的含量。

3.4 多年不同施肥處理對土壤酶活性的影響

土壤酶主要來自于土壤微生物代謝過程，此外也源于土壤動物和植物的分解。土壤中一切生化反應(yīng)都是在土壤酶的參與下完成的，土壤酶活性的高低能反映土壤生物活性和土壤生化反應(yīng)強度[38]。纖維素酶是可以表征土壤碳素循環(huán)速度的重要指標(biāo)，本研究發(fā)現(xiàn)，各種施肥處理對纖維素酶活性無顯著影響，這意味著不同施肥處理對土壤碳素循環(huán)速度的影響不顯著。脲酶能分解有機物，促其水解成氨和二氧化碳。本研究結(jié)果顯示，與水田相比，旱地中施肥處理使脲酶活性顯著提高，而在水田中各處理對脲酶活性的影響均不顯著。脫氫酶常被認(rèn)為是土壤微生物活性的一個有效指標(biāo)，其活性可以表征土壤腐殖質(zhì)化強度和有機質(zhì)積累的程度[39]。本研究結(jié)果顯示，PSTF+OF處理能顯著提高脫氫酶和過氧化氫酶活性。由此可見，長期施肥對土壤酶活性有很大的影響，其原因可能是長期施肥改變了土壤微生物量、區(qū)系組成，以及代謝過程，從而影響土壤酶的數(shù)量和活性[3]。

致謝:承蒙浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院張國平教授審閱并提出寶貴意見，在此深表謝意!

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