賀滟 賈蟬憶 韓楚依 侯宏保 陳遠(yuǎn)壽 韓勇

1遵義醫(yī)學(xué)院生理教研室（貴州遵義 563000）；2山西醫(yī)科大學(xué)藥劑學(xué)教研室（太原 030001）

20?羥二十烷四烯酸（20?hydroxyeicosatetraeno?ic acid，20?HETE）是由細(xì)胞色素P?450（CYP）酶催化花生四烯酸（arachidonic acid，AA）生成的重要血管活性物質(zhì)［1］。最近研究發(fā)現(xiàn)20?HETE通過(guò)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡作用，參與心肌缺血再灌注損傷（ischemia?reperfusion injury，IRI）進(jìn)程中，加重再灌注后心肌梗死面積的發(fā)生［2］，但其中機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。Ca2+作為重要的第二信使對(duì)于維持心肌細(xì)胞正常功能起到至關(guān)重要的作用，Ca2+平衡紊亂引發(fā)的鈣超載是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要因素［3-4］。在心肌細(xì)胞中，鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴(lài)性蛋白激酶（CaMKII）是調(diào)節(jié)Ca2+穩(wěn)態(tài)平衡的重要激酶，其激活后通過(guò)影響肌漿網(wǎng)Ryanodine（RyR2）受體通道、肌漿網(wǎng)鈣泵（SERCA2a）功能等作用引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+平衡紊亂，從而參與多種因素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡進(jìn)程中［5-6］。然而，目前尚無(wú)20?HETE對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度（［Ca2+］i）影響及相關(guān)作用機(jī)制的研究報(bào)道。因此，本研究主要觀察20?HETE對(duì)于培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響，并探究這其中CaMKII信號(hào)通路發(fā)揮的作用，為臨床治療相關(guān)缺血性心肌病提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 20?HETE、KN?93及Fluo?3/AM鈣離子熒光探針（Sigma公司，美國(guó)），II型膠原酶（Sigma公司，美國(guó)），DMEM/F12培養(yǎng)基（HyClone公司，美國(guó)），CCK?8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒（同仁公司，日本），TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物公司，中國(guó)），BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天公司，中國(guó)），小鼠抗SERCA2a（貨號(hào)ab205719）、小鼠抗RyR2（貨號(hào)ab205719）、兔抗CaMKIIδ（貨號(hào)ab205718）及兔抗磷酸化 CaMKIIδ（p?CaMKIIδ，貨號(hào)ab182647）（Abcam公司，美國(guó)），β?actin及HRP標(biāo)記二抗（Proteintech公司，美國(guó)），激光共聚焦顯微鏡（Leica公司，德國(guó)），CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo公司，美國(guó)）。

1.2 乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)采用1～3 d齡SD大鼠，購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。乳鼠開(kāi)胸取出心臟，在冷PBS中將心臟剪成1 mm3碎塊，心肌組織使用0.125%胰蛋白酶和0.01%的Ⅱ型膠原酶，37℃水浴消化10 min，反復(fù)消化6～8次至組織完全消化。將多次消化獲得細(xì)胞懸液1 000g離心10 min，棄上清，加入含15%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，37℃下5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)差速貼壁培養(yǎng)90 min，將分離純化的心肌細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中。培養(yǎng)液中加入15%胎牛血清，青、鏈霉素（100 U/mL，0.1 mg/mL）及終濃度100 μmol/L的5?溴脫氧尿嘧啶核苷（抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)），于5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱37℃下培養(yǎng)48 h后，更換無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)12 h后，隨機(jī)分為4組，A組：對(duì)照組，培養(yǎng)液不做任何藥物處理繼續(xù)培養(yǎng)24 h；B組：20?HETE組，培養(yǎng)液中加入100 nmol/L的 20?HETE 后繼續(xù)培養(yǎng) 24 h；C 組：20?HETE+KN?93組，培養(yǎng)液中加入KN?93（3 μmol/L）孵育30 min后加入100 nmol/L 20?HETE培養(yǎng)24 h；D組：KN?93組（3 μmol/L），培養(yǎng)液中加入KN?93后培養(yǎng)24 h。

1.4 CCK?8法檢測(cè)細(xì)胞活性 乳鼠心肌細(xì)胞于96孔板中更換無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h后，分別加入1、3、10、50和100 nmol/L不同濃度20?HETE，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在不同時(shí)段（0、6、12、18、24 h）檢測(cè)細(xì)胞活性，分別加入10 μL CCK?8溶液孵育2 h，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次，取平均值。

1.5 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 乳鼠心肌細(xì)胞使用不同藥物處理后，室溫下使用4%多聚甲醛溶液固定20 min，PBS溶液沖洗3次，0.1%Triton X?100溶液處理10 min，PBS沖洗后加入50 μL TUNEL反應(yīng)混合液，37℃下孵育60 mim，熒光顯微鏡下檢測(cè)結(jié)果。TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞為綠色熒光，計(jì)算每100個(gè)細(xì)胞中核陽(yáng)性熒光占百分比。

1.6 Fluo?3/AM熒光探針檢測(cè)心肌細(xì)胞［Ca2+］i乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)于蓋玻片上并經(jīng)不同藥物處理后，放入含5%的Pluronic F?127及Fluo?3/AM（5 μmol/L）的DMEM/F12溶液中避光負(fù)載40 min，負(fù)載后使用新鮮DMEM/F12溶液清洗多余染料。激光共聚焦顯微鏡下掃描細(xì)胞熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm，以平均熒光強(qiáng)度反映細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i，ImageJ軟件分析。

1.7 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 乳鼠心肌細(xì)胞于使用不同藥物處理后，加入細(xì)胞裂解液，離心后取上清液BCA法檢測(cè)蛋白濃度。取等量蛋白（上樣量60 μg）進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS?PAGE），轉(zhuǎn)膜后封閉1 h，分別加入一抗（小鼠抗SERCA2a、小鼠抗 RyR2、兔抗 CaMKIIδ以及兔抗p?CaMKIIδ）4℃搖床孵育過(guò)夜。一抗孵育后加入辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的二抗（抗小鼠或抗兔）室溫孵育1 h。ECL法顯影，暗室曝光，軟件分析蛋白條帶光度值，β?actin作為內(nèi)參，以靶蛋白/β?actin的比值反應(yīng)蛋白表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析及LSD?t方法檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 20?HETE對(duì)心肌細(xì)胞活性的影響 結(jié)果如圖1所示，1～3 nmol/L的20?HETE處理6～24 h對(duì)心肌細(xì)胞活性無(wú)顯著影響。與對(duì)照組和溶媒組相比，10、50及100 nmol/L的20?HETE處理18～ 24 h后，明顯引起心肌細(xì)胞損傷，其中100 nmol/L的20?HETE處理24 h后，細(xì)胞活性顯著下降至（58.3±4.22）%。結(jié)果表明20?HETE可以時(shí)間及濃度依賴(lài)性造成心肌細(xì)胞損傷。

2.2 KN?93對(duì)20?HETE誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡影響 前期研究發(fā)現(xiàn)20?HETE具有誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡作用，本研究檢測(cè)了CaMKII特異性抑制劑KN?93對(duì)20?HETE引起細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果如圖2所示，20?HETE處理后心肌細(xì)胞TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞明顯升高，由對(duì)照組的（2.31±1.32）%升至（49.8±2.3）%（P＜ 0.05），而加入KN?93后，細(xì)胞凋亡率恢復(fù)至（23.1±4.2）%（P＜0.05），表明CaMKII信號(hào)通路參與了20?HETE誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用。

2.3 20?HETE對(duì)［Ca2+］i影響及KN?93的作用 心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+的穩(wěn)定對(duì)于維持細(xì)胞正常功能具有重要作用，［Ca2+］i升高引起的鈣超載是誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素。因此，本研究應(yīng)用Fluo?3/AM熒光探針?lè)z測(cè)了20?HETE對(duì)［Ca2+］i的影響及KN?93的作用。結(jié)果如圖3所示，與對(duì)照組相比，20?HETE組心肌細(xì)胞［Ca2+］i顯著增加了75%（P＜0.05），而加入CaMKII特異性阻斷劑KN?93后，顯著阻斷了20?HETE誘導(dǎo)的［Ca2+］i升高（P＜0.05）。表明20?HETE具有顯著升高［Ca2+］i的作用，誘發(fā)細(xì)胞鈣超載，而CaMKII信號(hào)通路介導(dǎo)了該效應(yīng)。

2.4 20?HETE對(duì)RyR2、SERCA2a蛋白表達(dá)影響及KN?93的作用 蘭尼堿受體通道2（Ryanodine receptor 2，RyR2）和肌漿網(wǎng)鈣泵ATP酶（sarcoplas?mic reticulum Ca2+?ATPase2a，SERCA2a）是心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)膜上主要調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣釋放和回?cái)z的重要蛋白，同時(shí)也是受CaMKII調(diào)節(jié)的下游靶點(diǎn)。因此，為探究20?HETE誘導(dǎo)［Ca2+］i升高的機(jī)制，我們檢測(cè)了20?HETE對(duì)RyR2和SERCA2a的蛋白水平表達(dá)的影響以及KN?93的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20?HETE處理后的心肌細(xì)胞中，RyR2的蛋白表達(dá)量是對(duì)照組的3.3倍，而SERCA2a的蛋白表達(dá)比對(duì)照組下降32%（P＜0.05）；加入CaMKII特異性阻斷劑KN?93共同處理后，顯著抑制了20?HETE上述效應(yīng)。如上結(jié)果表明，20?HETE通過(guò)影響肌漿網(wǎng)鈣通道蛋白表達(dá)改變導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+平衡紊亂，同時(shí)CaMKII信號(hào)通路參與了20?HETE這種作用。

圖1 不同濃度和處理時(shí)間條件下20?HETE對(duì)心肌細(xì)胞活性的影響Fig.1 Effects of 20?HETE on cardiomyocyte activity at different concentrations and treating duration

圖2 KN?93對(duì)20?HETE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡影響Fig.2 Effects of KN?93 on 20?HETE?induced cardiomyocyte apoptosis

2.5 20?HETE 對(duì)CaMKIIδ表達(dá)及磷酸化的影響 CaMKIIδ亞型特異性表達(dá)于心肌組織，在心肌細(xì)胞的Ca2+調(diào)控中起動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)作用，CaMKIIδ表達(dá)升高、活性增強(qiáng)被認(rèn)為與細(xì)胞凋亡、肥大甚至心衰密切相關(guān)。因此，本研究通過(guò)Western Blot分析了20?HETE對(duì)CaMKIIδ蛋白和磷酸化水平的影響。結(jié)果如圖5所示，與對(duì)照組相比，20?HETE顯著增加了CaMKIIδ的表達(dá)并促進(jìn)其磷酸化水平升高（P＜ 0.05），KN?93阻斷了這種效應(yīng)。說(shuō)明20?HETE可通過(guò)激活CaMKII信號(hào)通路機(jī)制誘導(dǎo)心肌細(xì)胞［Ca2+］i升高及凋亡。

3 討論

20?HETE是由CYP酶家族中CYP4A和4F酶催化AA生成的重要血管活性物質(zhì)，大量研究表明20?HETE在調(diào)節(jié)腎、腦、骨骼肌和腸系膜等動(dòng)脈血管平滑肌肌源性收縮中發(fā)揮了重要的作用，它的合成與釋放與多種血管性疾病密切相關(guān)，如高血壓、血管內(nèi)皮功能紊亂、炎性反應(yīng)以及血管再生等［1，7］。近年研究發(fā)現(xiàn)CYP4A和4F酶在心肌組織中表達(dá)，在IRI進(jìn)程中，CYP4A和4F表達(dá)上調(diào)、20?HETE含量增加，WEI等［8］在體大鼠IRI研究發(fā)現(xiàn)，抑制20?HETE合成對(duì)改善大鼠再灌注后心肌具有顯著的保護(hù)作用，可有效減少心肌梗死面積的發(fā)生。然而，20?HETE參與IRI的具體作用機(jī)制尚待研究。臨床及實(shí)驗(yàn)研究表明，心肌細(xì)胞凋亡與IRI的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是再灌注損傷發(fā)病機(jī)制中重要環(huán)節(jié)［9］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，20?HETE可通過(guò)線(xiàn)粒體依賴(lài)的內(nèi)源性途徑誘導(dǎo)培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡［10］。此外，在離體大鼠心肌缺血再灌注模型中研究發(fā)現(xiàn)，20?HETE可通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)活性氧簇生成誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，加重再灌注后心肌損傷［2］。而在本研究中發(fā)現(xiàn)，CaMKII信號(hào)通路參與20?HETE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡進(jìn)程中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20?HETE呈濃度依賴(lài)性導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷，具有顯著的促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用；而應(yīng)用CaMKII特異性抑制劑——KN?93，阻斷了20?HETE這種作用，提示CaMKII信號(hào)通路參與了20?HETE誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，但其中具體機(jī)制尚需進(jìn)一步探究。

圖3 20?HETE對(duì)［Ca2+］i影響及KN?93的作用Fig.3 Effects of 20?HETE on［Ca2+］i and the role of KN?93

圖4 20?HETE對(duì)RyR2、SERCA2a蛋白表達(dá)影響及KN?93的作用Fig.4 Effects of 20?HETE on the expression of RyR2 and SERCA2a and the role of KN?93

Ca2+在心肌細(xì)胞的功能與代謝活動(dòng)中發(fā)揮了關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用，它不僅是興奮?收縮耦聯(lián)的重要因子，而且作為第二信使參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控［3-4］，目前已知的細(xì)胞凋亡三條途徑中（線(xiàn)粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑、死亡受體途徑）均與細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i升高引起的Ca2+超載密切相關(guān)。因此，為探究20?HETE誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡機(jī)制，本研究首先觀察了20?HETE對(duì)心肌細(xì)胞的［Ca2+］i影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)20?HETE可顯著升高心肌細(xì)胞［Ca2+］i，具有誘發(fā)鈣超載作用。在心肌細(xì)胞中，收縮期胞漿中Ca2+主要來(lái)源于肌漿網(wǎng)鈣庫(kù)，RyR2受體通道是釋放鈣庫(kù)Ca2+的主要途徑［11］。在舒張期，胞漿內(nèi)92%Ca2+的清除通過(guò)SERCA2a的攝取作用轉(zhuǎn)運(yùn)回肌漿網(wǎng)［3］，心肌細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)控與RyR2和SER?CA2a的功能密切相關(guān)。因此，本研究觀察了20?HETE對(duì)肌漿網(wǎng)RyR2和SERCA2a表達(dá)的影響，探究20?HETE誘導(dǎo)心肌細(xì)胞鈣超載機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20?HETE一方面可以促進(jìn)RyR2表達(dá)升高，其結(jié)果引起肌漿網(wǎng)鈣庫(kù)釋放Ca2+能力增強(qiáng)；另一方面20?HETE降低了SERCA2a表達(dá)，導(dǎo)致舒張期肌漿網(wǎng)對(duì)Ca2+回?cái)z能力下降，通過(guò)這兩方面機(jī)制導(dǎo)致［Ca2+］i升高，誘發(fā)鈣超載。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用KN?93抑制CaMKII作用顯著阻斷了20?HETE誘發(fā)的鈣超載的效應(yīng)。

CaMKII是機(jī)體內(nèi)重要的蛋白激酶，包括四種亞型，CaMKIIα和CaMKIIβ主要表達(dá)于神經(jīng)組織，CaMKIIγ和CaMKIIδ在多種組織中存在，在心臟中主要表達(dá) CaMKIIδ［6］。近年研究表明，CaMKII在心肌肥大、細(xì)胞凋亡甚至心衰發(fā)病進(jìn)程發(fā)揮關(guān)鍵作用［12-14］。在心肌細(xì)胞凋亡進(jìn)程中，CaMKII的蛋白表達(dá)增高、磷酸化水平增強(qiáng)［13］，而活化的CaM?KII可通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+平衡，其中肌漿網(wǎng)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白R(shí)yR2和SERCA2a是其重要的下游調(diào)節(jié)靶點(diǎn)［3］。CaMKII激活后，一方面通過(guò)磷酸化RyR2，增加后者對(duì)Ca2+的敏感性，增加肌漿網(wǎng)鈣庫(kù)Ca2+釋放；另一方面通過(guò)對(duì)受磷蛋白（phos?pholamban，PLB）磷酸化，解除其對(duì)SERCA2a抑制作用，增強(qiáng)肌漿網(wǎng)對(duì) Ca2+的回?cái)z［5，15］。在本研究中發(fā)現(xiàn)，20?HETE顯著上調(diào)CaMKIIδ蛋白表達(dá)，同時(shí)提高其Thr287位點(diǎn)磷酸化水平，表明20?HETE具有明顯激活CaMKII的作用，20-HETE通過(guò)對(duì)CaMKII的激活繼而影響RyR2和SERCA2a功能的改變，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡的調(diào)節(jié)紊亂，誘發(fā)鈣超載。雖然CaMKII激活后，其直接作用是磷酸化PLB、增強(qiáng)SERCA2a功能，促進(jìn)Ca2+回?cái)z至肌漿網(wǎng)內(nèi)，但有研究表明，SERCA2a回?cái)zCa2+功能還依賴(lài)于SERCA2a表達(dá)與磷酸化PLB的比率［16］。本研究中發(fā)現(xiàn)20?HETE可降低SERCA2a總蛋白的表達(dá)，因此通過(guò)減小SERCA2a與PLB的比率，從而降低了SERCA2a回?cái)zCa2+能力。如上結(jié)果表明，20?HETE一方面通過(guò)直接影響RyR2和SERCA2a的蛋白表達(dá)；另一方面通過(guò)激活CaMKII間接影響RyR2和SERCA2a功能，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+平衡的紊亂。

近年研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)多種活性物質(zhì)，如異丙腎上腺素、血管緊張素Ⅱ、腎上腺素、內(nèi)皮素等具有激活CaMKII作用，從而參與相關(guān)心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展［6，12，17-18］，而本研究中發(fā)現(xiàn)，20?HETE 可上調(diào)CaMKII蛋白表達(dá)、磷酸化水平增強(qiáng)，表明20?HETE具有顯著激活CaMKII效應(yīng)，并通過(guò)CaMKII介導(dǎo)了其導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)鈣超載和細(xì)胞凋亡作用。雖然20?HETE激活CaMKII的具體機(jī)制尚待探明，但我們前期研究發(fā)現(xiàn)，20?HETE具有激活心肌細(xì)胞L?型鈣離子通道、增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度以及誘發(fā)細(xì)胞內(nèi) ROS 生成等生物作用［2，19］，細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度升高是激活CaMKII的必要條件，而細(xì)胞內(nèi)ROS水平增高則可對(duì)CaMKII調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域氧化修飾，阻止與催化結(jié)構(gòu)域的重新結(jié)合從而保持激酶活性［6］。因此，20?HETE 對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度及ROS生成的影響是其激活CaMKII的重要的潛在機(jī)制。

綜上所述，以往的研究發(fā)現(xiàn)20?HETE通過(guò)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡參與IRI進(jìn)程中，本研究在培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，20?HETE通過(guò)激活CaM?KII，引起肌漿網(wǎng)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白R(shí)yR2和SERCA2a功能改變，導(dǎo)致心肌細(xì)胞鈣超載，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，這可能是20?HETE加重IRI損傷的重要機(jī)制之一。如上發(fā)現(xiàn)為臨床治療相關(guān)的缺血性心肌病以及心衰的藥物治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)與新思路。

圖5 20?HETE對(duì)CaMKIIδ表達(dá)及磷酸化的影響Fig.5 Effects of 20?HETE on CaMKIIδ protein expression and phosphorylation

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