鄭世超，孟靜，翟清燕，郭穎慧，霍勝楠

(山東省食品藥品檢驗研究院，濟南 250101)

火鍋，是中國獨創(chuàng)的美食，歷史悠久?；疱佌{(diào)料是以芝麻醬、腐乳、韭菜花、料酒、特制醬油、小磨香油、增鮮劑和一些營養(yǎng)價值較高的當(dāng)歸、人參、大棗、桂圓等，按一定比例混合配制加工制成的，其中富含人體所必需的氨基酸、糖類、維生素等多種營養(yǎng)物質(zhì)，具有豐富的營養(yǎng)價值[1]。由于火鍋調(diào)料原料種類繁多，故其生產(chǎn)車間環(huán)境中的微生物繁雜，若是殺菌和灌裝環(huán)境等控制不好，將導(dǎo)致調(diào)料遭受二次污染，在貨架期內(nèi)產(chǎn)生“脹袋”現(xiàn)象。此外，在存儲運輸過程中也容易出現(xiàn)微生物大量滋生而引起的腐敗變質(zhì)問題，這不僅會影響食用的口感，更會威脅人體的健康，同時又帶來了不小的經(jīng)濟損失，因此食品的防腐就顯得至關(guān)重要[2-4]。我們采用形態(tài)學(xué)、生理生化特征鑒定、16S rDNA序列分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，對某品牌脹袋火鍋調(diào)料產(chǎn)品的腐敗微生物進行初步分析，以期為其質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

某品牌脹袋火鍋調(diào)料。

1.2 培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏粉3.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，瓊脂20.0 g/L，pH (7.3±0.2)，加熱融化后于121 ℃滅菌20 min。

淀粉酶檢測培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏3.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，可溶性淀粉20.0 g/L，瓊脂20.0 g/L，pH 7.4～7.6，加熱融化后于121 ℃滅菌20 min。

蛋白酶檢測培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏3.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，干酪素10.0 g/L，瓊脂20.0 g/L，pH 7.4 ～7.6，加熱融化后于121 ℃滅菌20 min。

1.3 試劑

細菌基因組提取試劑盒：購于杭州博日科技有限公司(BIOER)；dNTPs，Taq DNA聚合酶及其緩沖液，DNA Marker，RNase A：均購于大連寶生物有限公司；引物：由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 儀器

SPL-250生化培養(yǎng)箱 天津萊玻特瑞公司；Base梯度PCR儀 美國ABI公司；NanoDrop 2000c紫外可見分光光度計、ST40 臺式離心機 美國賽默飛世爾公司；Comfort恒溫混勻器 德國艾本德公司；MS204S 電子天平 梅特勒公司；Qiaxecl Advanced毛細管電泳儀 德國凱杰公司；10009000抑菌圈測量儀 西班牙IUL公司；MLS-3781L高壓蒸氣滅菌鍋 日本三洋公司；BX53F-SZX7顯微成像系統(tǒng) 日本奧林巴斯公司。

1.5 實驗方法

1.5.1 腐敗微生物的分離與純化

稱取25 g樣品置于盛有225 mL磷酸鹽緩沖液的無菌均質(zhì)袋內(nèi)，8000 r/min均質(zhì)2 min，制成1∶10的樣品勻液。用1 mL槍頭吸取1∶10樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注入盛有9 mL稀釋液的無菌試管中，振搖試管使其混合均勻，制成1∶100的樣品勻液。上述操作，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1次1 mL槍頭。選擇10-1，10-2，10-33個稀釋度的樣品勻液，吸取1 mL樣品勻液涂布營養(yǎng)瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)48 h。同時，分別吸取1 mL空白稀釋液涂布于2個營養(yǎng)瓊脂平板作空白對照。挑選不同形態(tài)的菌落，用營養(yǎng)瓊脂平板劃線培養(yǎng)，獲得單菌落。將涂布培養(yǎng)好的平板，挑取單菌落少許于營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h，待長出菌苔后，進行鏡檢，且不斷進行分離純化，直至獲得純培養(yǎng)。

1.5.2 形態(tài)學(xué)觀察

將待試驗的菌株接種在營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基上，37 ℃條件下培養(yǎng)48 h，觀察并記錄菌落形態(tài)、顏色、透明度、邊緣是否整齊等。挑取純培養(yǎng)的單個菌落，進行革蘭氏染色、芽孢染色鏡檢。

1.5.3 產(chǎn)酶活性的檢測

采用平板透明圈法。將篩選純化的菌株分別點種于淀粉酶選擇培養(yǎng)基平板和蛋白酶選擇培養(yǎng)基平板上，設(shè)置3個平行，37 ℃培養(yǎng)24 h，滴加盧戈氏碘液，顯色后觀察平板透明圈的有無及大小，測定其水解透明圈直徑(H)與菌落直徑(C)，計算H/C值，用來表示菌株產(chǎn)酶活力[5]。

1.5.4 生理生化鑒定

挑取純培養(yǎng)的單個菌落進行鑒定，分別進行接觸酶、葡萄糖利用、甘露醇產(chǎn)酸、阿拉伯糖產(chǎn)酸、檸檬酸鹽利用、水解淀粉、明膠液化、吲哚實驗、厭氧生長、耐鹽實驗等生理生化實驗鑒定。按《伯杰細菌鑒定手冊》及《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》進行初步鑒定[6,7]。

1.5.5 基因組DNA的提取和16S rDNA序列擴增

1.5.5.1 基因組DNA的提取

收集細菌，取0.5～4 mL細菌，13.000 g離心1 min，棄上清；加入100 μL EL Buffer，使用槍頭吹打均勻，37 ℃溫育10～60 min；加入100 μL RS Buffer，隨后分別加入10 μL PK Solution，充分混勻，加入2 μL RNase A(20 mg/mL)并混勻；于56 ℃環(huán)境中溫浴15 min，然后移出；加 200 μL GA Buffer 并混合均勻；于13.000 g 離心1 min；將上清液轉(zhuǎn)移到一個新的1.5 mL離心管中，加 400 μL的Buffer BA，并混合均勻；將混合液體轉(zhuǎn)移至Spin column，于13.000 g離心1 min，并棄去接液管中液體；向 Spin column中加入500 μL的G Binding Buffer，于10.000 g離心1 min，并棄去接液管中液體；向Spin column中加入500 μL的Wash Buffer，于10.000 g 離心1 min，并棄去接液管中液體，重復(fù)上述步驟；再次將Spin column于10.000 g離心1 min，并將Spin column轉(zhuǎn)移至一個新的1.5 mL離心管中；向 Spin column 中加入100 μL Elution Buffer，并于室溫溫育1 min；于10.000 g 離心1 min，并棄去Spin column。

1.5.5.2 16S rDNA序列擴增

16S rDNA PCR擴增的正向引物為27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物為1492R：5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR擴增25 μL反應(yīng)體系：PCR反應(yīng)體系為起始引物(10 μmol/L) 1 μL，終止引物(10 μmol/L)1 μL，模板基因組DNA 2 μL，Taq酶12.5 μL，加無菌雙蒸水調(diào)整反應(yīng)總體系體積為25 μL。反應(yīng)條件為95 ℃變性5 min；95 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s, 72 ℃延伸2 min，共進行40次循環(huán)，72 ℃延伸7 min，4 ℃保溫。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，將PCR產(chǎn)物送至上海博尚生物技術(shù)有限公司測序。測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進行BLAST比對，確定菌株的種屬性質(zhì)，利于MEGA 6.06構(gòu)造系統(tǒng)發(fā)育樹，討論這3種菌與其他細菌之間的親緣關(guān)系[8]。

2 結(jié)果和分析

2.1 菌株分離及形態(tài)學(xué)觀察

通過1.5.1的實驗步驟，選取10-2平皿，見圖1。通過分離純化，獲得3株腐敗微生物菌株，見圖2。分別命名為H-1，H-2，H-3，3個菌株在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上于37 ℃培養(yǎng)48 h，其中，H-1菌落呈白色半透明，光滑濕潤，革蘭氏染色結(jié)果為陽性短桿狀細菌，見圖3；H-2菌落不透明，干燥，邊緣不整齊，扁平，菌落表面有皺褶，革蘭氏陽性鏈桿菌，見圖4；H-3菌落較大，圓形，灰白色，表面粗糙不透明，邊緣不整齊，革蘭氏陽性桿菌，見圖5。3株菌通過芽孢染色，均有芽孢。

圖1 微生物在NA培養(yǎng)基上的特征Fig.1 Characteristics of microorganisms on NA medium

圖2 分純后菌株在NA斜面上的特征Fig.2 Characteristics of pure strains on NA slope

圖3 菌株H-1的顯微形態(tài)特征Fig.3 Microscopic morphological characteristics of strain H-1

圖4 菌株H-2的顯微形態(tài)特征Fig.4 Microscopic morphological characteristics of strain H-2

圖5 菌株H-3的顯微形態(tài)特征Fig.5 Microscopic morphological characteristics of strain H-3

2.2 生理生化鑒定

按照芽孢桿菌的生理生化鑒定實驗要求[9-12]，這3個菌株的生理生化結(jié)果見表1。

表1 菌株的生理生化實驗Table 1 Physiological and biochemical test for the strains

注：“+”為陽性，“-”為陰性。

2.3 16S rDNA鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

3種菌株經(jīng)PCR測序獲得16S rDNA序列(約1.4 kb)，見圖6。DNA測序序列見表2～表4，根據(jù)表2～表4對H-1的序列進行BLAST分析，得到同源序列，用CLUSTAL×2.0 program對序列進行比對，進一步使用MEGA 6.06軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進化樹的構(gòu)建選用Neighbor-Joining(NJ)方法，bootstrap replicates檢測值為1000，見圖 7。

圖6 H-1，H-2，H-3 16S rDNA PCR擴增電泳圖Fig.6 H-1, H-2, H-3 16S rDNA PCR amplified electrophoresis

注：1為H-1；2為H-2；3為空白對照；4為H-3；5為陽性對照。

圖7 基于H-1 16S rDNA序列構(gòu)建的菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 The strain's phylogenetic tree based on H-1 16S rDNA sequence

由圖7可知，H-1菌株屬于芽孢桿菌分支，與解淀粉酶芽胞桿菌BacillusamyloliquefaciensSRCM101267 最接近，與該菌株的同源性達100%。因此，綜合生理生化實驗鑒定結(jié)果和分子鑒定結(jié)果，可鑒定H-1菌株為解淀粉芽孢桿菌。菌株H-1 16S rDNA測序結(jié)果見表2。

表2 菌株H-1 16S rDNA測序結(jié)果Table 2 Sequencing results of strain H-1 16S rDNA

對H-2的序列進行BLAST分析，得到同源序列，用CLUSTAL×2.0 program對序列進行比對，進一步使用MEGA 6.06軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進化樹的構(gòu)建選用 Neighbor-Joining(NJ)方法， bootstrap replicates檢測值為1000，見圖8。

圖8 基于H-2 16S rDNA序列構(gòu)建的菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.8 The strain's phylogenetic tree based on H-2 16S rDNA sequence

由圖8可知，H-2菌株屬于地衣芽孢桿菌Bacilluslicheniformis的分支，與該地衣芽孢桿菌中的其他菌株同源性達99%。因此，綜合生理生化實驗鑒定結(jié)果和分子鑒定結(jié)果，可鑒定H-2菌株為地衣芽孢桿菌，菌株H-2 16S rDNA測序結(jié)果見表3。

表3 菌株H-2 16S rDNA測序結(jié)果Table 3 Sequencing results of strain H-2 16S rDNA

對H-3的序列進行BLAST分析，得到同源序列，用CLUSTAL×2.0 program對序列進行比對，進一步使用MEGA 6.06軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進化樹的構(gòu)建選用 Neighbor-Joining(NJ)方法， bootstrap replicates檢測值為1000，見圖9 。

圖9 基于H-3 16S rDNA序列構(gòu)建的菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.9 The strain's phylogenetic tree based on H-3 16S rDNA sequence

由圖9可知，H-3菌株屬于枯草芽孢桿菌Bacillus的分支，與枯草芽孢桿菌中的Bacillussubtilisstrain 6B8 (KR611046.1)和Bacillussubtilisstrain 2C-62 (KR061403.1)同源性達100%。因此，綜合生理生化實驗鑒定結(jié)果和分子鑒定結(jié)果，可鑒定H-3菌株為枯草芽孢桿菌。淀粉酶、蛋白酶活力測定實驗結(jié)果見表4。

表4 菌株H-3 16S rDNA測序結(jié)果Table 4 Sequencing results of strain H-3 16S rDNA

2.4 產(chǎn)酶活性檢測

利用平板透明圈法進行產(chǎn)酶實驗，3個菌株產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶透明圈大小結(jié)果，見表5。表明H-1和H-2具有較強的產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶活力，H-3產(chǎn)蛋白酶活力較高，而產(chǎn)淀粉酶活力一般。

表5 淀粉酶、蛋白酶活力測定實驗結(jié)果Table 5 The experimental results of amylase and protease activity

3 結(jié)果與討論

該火鍋調(diào)料在適宜溫度下貯存，在保質(zhì)期內(nèi)發(fā)生鼓脹變質(zhì)，經(jīng)形態(tài)檢驗、生理生化反應(yīng)、16S rDNA序列分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，確定3株腐敗微生物分別為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

芽孢桿菌是一類好氧微生物，具有抗逆性強、營養(yǎng)需求低、復(fù)活率高等特點，其生長速度快，可以產(chǎn)多種酶類，但是其耐熱性強，若是后期含量很高，會對殺菌帶來一定困難。芽孢桿菌的安全性問題一直是人們關(guān)注的問題。近年來，芽孢桿菌引起水產(chǎn)動物腐皮病、敗血癥等病害的相繼報道也進一步說明了芽孢桿菌對機體存在致病的威脅[13-18]。

由于調(diào)味品中成分復(fù)雜，加工工藝中加入了較多的輔料，可能引入不同的細菌，采用80 ℃滅菌10～20 min的方法因傳熱不均勻，雖能殺死大部分酵母和霉菌，但是一些耐高溫的芽孢菌仍能生存，使調(diào)味品腐敗變質(zhì)，本文研究的調(diào)味品中分離的腐敗微生物大多為芽孢桿菌屬，說明芽孢桿菌屬為優(yōu)勢菌屬，這是影響保質(zhì)期產(chǎn)品質(zhì)量的主要污染源，導(dǎo)致火鍋調(diào)料受二次污染及產(chǎn)品質(zhì)量發(fā)生變質(zhì)后的產(chǎn)品則表現(xiàn)為脹袋，給儲存和銷售帶來不利影響。所以，為保持火鍋調(diào)料鮮香的風(fēng)味，在成品調(diào)料不滅菌的情況下首先進行生產(chǎn)環(huán)境滅菌，即在生產(chǎn)過程中要保證與產(chǎn)品接觸的人員、器皿、環(huán)境均保持無微生物污染；針對不同微生物，使用不同的滅菌方法[19-21]。此外，把握包裝時環(huán)境和操作的控制，包裝時要保證包裝機器和操作都是無菌操作。本研究對脹袋火鍋調(diào)料進行分析，得到能引起變質(zhì)的腐敗微生物，為滅菌工藝的改善，保質(zhì)期的延長提供了參考依據(jù)。

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