李荔，童星

(佛山市海天調(diào)味食品股份有限公司，廣東 佛山 528000)

制曲是我國釀造工業(yè)的一項(xiàng)傳統(tǒng)技術(shù)，廣泛應(yīng)用于多類傳統(tǒng)發(fā)酵食品(醬油、醬類、豆豉、腐乳等) 的生產(chǎn)。制曲的實(shí)質(zhì)是創(chuàng)造微生物生長的最適條件促進(jìn)蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等的分泌從而將原料中的蛋白質(zhì)、淀粉、纖維素水解產(chǎn)生氨基酸、多肽、葡萄糖等復(fù)雜的風(fēng)味物質(zhì)。在醬油生產(chǎn)過程中，米曲霉和醬油曲霉是常用的菌株，對(duì)醬油生產(chǎn)的原料利用率和醬油的風(fēng)味起著決定性的作用[1]。我國自1957年全國醬油試點(diǎn)確定選用米曲霉3.863以后, 全國各地紛紛采用米曲霉及其變異株來生產(chǎn)醬油。米曲霉3.042是上海釀造實(shí)驗(yàn)工廠對(duì)原種AS3.863通過人工誘變得到的1株優(yōu)良醬油釀造用菌株, 現(xiàn)已在全國普遍使用[2]。日本學(xué)者于20世紀(jì)30年代從醬曲中分離得到可產(chǎn)生大量堿性蛋白酶和高谷氨酰胺酶特性的醬油曲霉，并受到廣泛重視，是日本醬油釀造的主要菌種之一[3,4]。我國因偏重米曲霉的應(yīng)用，目前對(duì)醬油曲霉的關(guān)注不多。

近年來，不少學(xué)者提出了多菌種應(yīng)用提高制曲質(zhì)量的設(shè)想。李琴等[5]研究了米曲霉和黑曲霉混合制曲提高醬油釀造原料的利用率和風(fēng)味。王素珍等[6]通過米曲霉與增香曲的復(fù)合應(yīng)用，提高了醬油的紅黃指數(shù)和改善了烹飪效果，均取得了一定的進(jìn)展。目前關(guān)于米曲霉和醬油曲霉復(fù)合制曲的研究報(bào)道較少，本文通過分析米曲霉和醬油曲霉雙菌混合制曲對(duì)酶系的分泌及發(fā)酵指標(biāo)風(fēng)味的影響，以期為醬油現(xiàn)代生產(chǎn)技術(shù)的提升提供理論基礎(chǔ)，解決單一菌株制曲存在的風(fēng)味不足問題。

1 材料與方法

1.1 材料

AS3.042(Aspergillusoryzae)和HT.AS125(Aspergillussojae)來自保藏菌株；大豆、面粉均為市售：其他試劑均為分析純。

KDN-04A 定氮儀 上海昕瑞儀器儀表有限公司；722 微機(jī)型可見分光光度計(jì) 上海精密儀器有限公司；DK-S26電熱恒溫水浴鍋 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；PB-10 sartorius pH計(jì) 德國賽多利斯集團(tuán)；FA/JA 系列電子天平 上海上平儀器公司；Leu-Gly-Gly 上海西寶生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 制曲方法

以重量百分比計(jì)，取70%黃豆，1.2 倍潤水，用高壓蒸汽滅菌鍋115 ℃蒸料15 min。熟料快速冷卻至37～40 ℃，拌入30%的面粉，按原料重量接入0.15%(m/m)曲霉菌種，拌勻。按照通風(fēng)制曲培養(yǎng)方式進(jìn)行培養(yǎng)，溫度控制在30～35 ℃，制曲時(shí)間42 h。

1.2.2 混合制曲菌種復(fù)合方法

將AS3.042和HT.AS125曲種烘干磨碎按照重量比1∶0,6∶1,4∶1,2∶1,1∶1,0∶1進(jìn)行混合拌料菌種，按照1.2.1的方法進(jìn)行制曲。

1.2.3 發(fā)酵方法

采用高鹽稀態(tài)發(fā)酵法，30 ℃發(fā)酵60天，對(duì)發(fā)酵醪汁過濾取濾液進(jìn)行分析。

1.2.4 檢測(cè)方法

1.2.4.1 粗酶液提取

稱取5 g成曲，研磨后加入60 mL蒸餾水，40 ℃浸提1 h，每間隔20 min攪拌1次。根據(jù)不同酶活測(cè)定所需的緩沖液分別定容到合適的濃度，中速定性濾紙過濾即為粗酶液。同時(shí)測(cè)定曲料水分，酶活力統(tǒng)一用曲料干基重量表示，即U/g。

1.2.4.2 中性蛋白酶活力測(cè)定

參照國標(biāo)GB/T 23527-2009[7]，采用福林法測(cè)定中性條件下pH值為7.2的蛋白酶活力，酶活定義：在40 ℃每1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需酶量，定義為1個(gè)蛋白酶活力單位。

1.2.4.3 氨肽酶活力測(cè)定

以L-亮氨酸-對(duì)硝基苯胺為底物，在40 ℃，pH值為8.0條件下，每1 min水解生成1 μg對(duì)硝基苯胺所需要的酶量定義為1個(gè)酶活力單位[8]。

1.2.4.4 谷氨酰胺酶活力測(cè)定[9]

在40 ℃，pH值為7.2的條件下，每1 g醬油曲中的谷氨酰胺酶每1 min催化L-谷氨酰胺分解生成1 μmol L-谷氨酸，即為1個(gè)酶活力單位，以U/g表示。

1.2.4.5 α-淀粉酶的測(cè)定

采用DNS試劑法[10]，以50 ℃，pH 4.8，每1 min水解淀粉生成1 μg葡萄糖為1個(gè)酶活力單位(U)。

1.2.4.6 理化指標(biāo)的檢測(cè)

全氮測(cè)定參照《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》方法(GB/T 5009.5-2003)；氨基酸態(tài)氮和總酸采用電位滴定儀方法(GB/T 5009.39-2003)；還原糖測(cè)定參照《食品中還原糖的測(cè)定》方法(GB/T 5009.7-2008)。

1.2.4.7 氨基酸生成率

氨基酸生成率(%)=醬油中氨基酸態(tài)氮含量/醬油中全氮含量×100%。

1.2.5 數(shù)據(jù)整理和分析

所有的試驗(yàn)均進(jìn)行3次平行取平均值，采用SPSS 11.5和Origin 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AS3.042和HT.AS125酶系的差異

按照上述方法對(duì)比分析了AS3.042和HT.AS125單獨(dú)制曲產(chǎn)酶的差異，結(jié)果見圖1。

圖1 AS3.042和HT.AS125制曲酶系對(duì)比

由圖1可知,AS3.042的中性蛋白酶和α-淀粉酶活力較高；HT.AS125的谷氨酰胺酶和氨肽酶活力較高，中性蛋白酶低。說明兩類菌株的產(chǎn)酶特性存在顯著的差異，這與菌株自身的特性有一定的關(guān)系。較高的谷氨酰胺酶和氨肽酶活力是HT.AS125菌株的重要特性，這為雙菌株的復(fù)合制曲提供了可能。

2.2 不同菌種復(fù)配比例對(duì)制曲質(zhì)量的影響

AS3.042和HT.AS125按照菌種比例1∶0，6∶1，4∶1，2∶1，1∶1和0∶1進(jìn)行混合制曲，從成曲的酶系、pH值等幾個(gè)角度分析2種曲霉混合制曲對(duì)制曲質(zhì)量的影響，結(jié)果見圖2和表1。

圖2 AS3.042和HT.AS125不同比例復(fù)合制曲酶系對(duì)比

AS3.042∶HT.AS125pH水分(%)成曲感官1∶06.1428.1曲料生長均勻,外觀黃綠色,具有特有的曲香味,無氨味和酸味6∶16.4627.9曲料生長均勻,外觀黃綠色,具有特有的曲香味,無氨味和酸味4∶16.4728.8曲料生長均勻,外觀黃綠色,具有特有的曲香味,略帶蘑菇香2∶16.7428.7曲料生長均勻,孢子略少,具有特有的曲香味,帶有蘑菇香1∶16.7528.5曲料生長均勻,色澤偏暗,孢子較少,具有特有的曲香味和蘑菇香0∶16.9828.7曲料生長均勻,色澤偏暗,產(chǎn)孢少,具有特有的蘑菇香氣味

從2種菌株復(fù)合后曲料的指標(biāo)來看，米曲霉中添加一定比例的醬油曲霉，隨著醬油曲霉的增多，曲料的中性蛋白酶和淀粉酶呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，而曲料的谷氨酰胺酶、氨肽酶、pH呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì)，雙菌復(fù)合制曲成曲的指標(biāo)介于米曲霉和醬油曲霉單獨(dú)制曲之間，說明2種菌株在制曲過程中分別發(fā)揮了自己的特點(diǎn)。但從變化規(guī)律來看，各指標(biāo)無明顯的線性規(guī)律，這主要與2種菌株之間的相互競(jìng)爭協(xié)同作用有一定的關(guān)系。對(duì)比成曲的感官，AS3.042和HT.AS125按照6∶1復(fù)合時(shí)曲料的香氣和感官與AS3.042單獨(dú)培養(yǎng)比較接近；按照2∶1復(fù)合時(shí)曲料的感官的孢子生長和香氣已經(jīng)有明顯的改變，說明醬油曲霉HT.AS125在混合菌株中已發(fā)揮較大的作用。

2.3 不同比例菌株復(fù)合發(fā)酵結(jié)果分析

根據(jù)制曲結(jié)果分析，2個(gè)菌株復(fù)合后在蛋白酶和氨肽酶、谷氨酰胺酶方面存在顯著性差異，因此以氨基氮、全氮、谷氨酸、氨基酸/全氮等指標(biāo)作為菌種復(fù)合比例確定的依據(jù)，結(jié)果見表2。

表2 不同比例菌株復(fù)合對(duì)發(fā)酵質(zhì)量的影響

從發(fā)酵結(jié)果可以看出，米曲霉與醬油曲霉雙菌種制曲后還原糖和全氮有一定的下降，這與醬油曲霉的蛋白酶和淀粉酶活力較低有直接的關(guān)系，但氨基氮和谷氨酸均有不同程度的提升。結(jié)合發(fā)酵油的感官鑒評(píng)結(jié)果，AS3.042和HT.AS125按照4∶1的比例復(fù)合，醬油的滋味有明顯的改善，表現(xiàn)為鮮甜較好，口感協(xié)調(diào)，同時(shí)醬油的醬香較好，保留了原始產(chǎn)品的特征。AS3.042和HT.AS125按照1∶1的比例進(jìn)行復(fù)合，醬油的氨基氮/全氮和谷氨酸生成率均有明顯的提升，醬油具有鮮味突出的特點(diǎn)，但由于在香氣方面已改變了原有菌株的特色，同時(shí)全氮較低，不適合在生產(chǎn)中應(yīng)用。綜合考慮，AS3.042和HT.AS125按照4∶1復(fù)合作為最佳的配比，氨基氮生成率提高5.37%，谷氨酸生成提高25.41%，釀造醬油的風(fēng)味得到明顯改善。

2.4 不同制曲溫度對(duì)AS3.042和HT.AS125復(fù)合制曲產(chǎn)酶的影響

制曲過程分為曲霉的菌絲生長期和產(chǎn)酶期，制曲溫度是影響曲霉生長和產(chǎn)酶最重要的因素之一。為研究混合制曲最佳的產(chǎn)酶溫度，菌種比例按照AS3.042∶HT.AS125為4∶1混合，在第1次松曲以后，設(shè)置了26，28，30，32，34 ℃進(jìn)行培養(yǎng)，分析谷氨酰胺酶生成能力，結(jié)果見圖3。

圖3 不同培養(yǎng)溫度下谷氨酰胺酶的生成情況

谷氨酰胺酶的生成主要集中在12～36 h，與培養(yǎng)溫度有較大關(guān)系。在12～20 h期間，培養(yǎng)溫度越高，谷氨酰胺酶的生成速率越快；20 h以后，26～30℃的溫度更加有利于谷氨酰胺酶的分泌，最適合的溫度為28 ℃，谷氨酰胺酶活力達(dá)到4.65 U/g。32 ℃時(shí)谷氨酰胺酶的分泌呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，34 ℃時(shí)谷氨酰胺酶活力最低，說明在制曲過程中谷氨酰胺酶的生成適合偏低溫的環(huán)境。

3 結(jié)論

本文通過研究米曲霉與醬油曲霉雙菌復(fù)合制曲，取得了以下結(jié)果：

米曲霉AS3.042和HT.AS125在酶的分泌上具有互補(bǔ)的特點(diǎn)，米曲霉AS3.042中性蛋白酶和淀粉酶活力較高，HT.AS125谷氨酰胺酶和氨肽酶活力較高，其中HT.AS125是AS3.042的1.48倍。

確定了AS3.042和HT.AS125菌種復(fù)合制曲的最佳比例為4∶1，氨基氮生成率提高5.37%，谷氨酸生成率提高25.41%。

確定了AS3.042和HT.AS125菌種復(fù)合制曲最適合生成谷氨酰胺酶的制曲溫度是28 ℃，谷氨酰胺酶活力達(dá)到4.65 U/g。

結(jié)果表明：米曲霉與醬油曲霉混合制曲對(duì)于改善醬油風(fēng)味有較好的應(yīng)用效果，與米曲霉與黑曲霉復(fù)合制曲相比，解決了黑曲霉制曲過程中黑色孢子的環(huán)境污染問題，有良好的應(yīng)用前景。下一步可繼續(xù)研究米曲霉與醬油曲霉混合制曲過程中的協(xié)同作用機(jī)理和競(jìng)爭抑制關(guān)系，為工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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