王婧茹 黃存金

隨著生物技術(shù)不斷的發(fā)展進(jìn)步，法醫(yī)DNA分析技術(shù)在案件偵破中的重要作用日益顯著。在大部分的性侵害案件中的生物物證是附著在載體上的各種斑跡，多為男性精液與女性的陰道分泌物組成的混合斑跡，但混合斑跡往往不能很好地發(fā)揮證據(jù)效能。所以為了能夠更好的服務(wù)于性侵害類案件的偵破，就需要在混合斑跡中分離出單獨(dú)的精子細(xì)胞DNA分型 [1]。但這類檢材的檢驗(yàn)往往很難處理，尤其是男性精子細(xì)胞數(shù)量較少，與大量的女性上皮細(xì)胞混合在載體上，想要采用常規(guī)方法把男性細(xì)胞從載體上進(jìn)行分離檢驗(yàn)十分困難，多數(shù)情況下獲得的分型結(jié)果不是單一的男性分型，而是男女組分都存在的混合分型 [2]。所以為進(jìn)一步提高精子細(xì)胞分離的效率，為案件偵破提供理論依據(jù)，為新分離方法的研發(fā)提供科研思路，本文對(duì)現(xiàn)有的精液混合斑的分離提取方法進(jìn)行綜合評(píng)述：

1 差異裂解法

差異裂解法是大部分科研人員最常用的方法，該方法利用精子細(xì)胞膜含有豐富的二硫鍵，與上皮細(xì)胞外膜特性不同的原理，通過先用十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate， SDS）和蛋白酶K裂解女性的陰道上皮細(xì)胞膜，將陰道上皮細(xì)胞的DNA分離出來后，再利用二硫蘇糖醇（dithiothreitol， DTT）裂解男性精子細(xì)胞膜，然后再用常規(guī)的方法提取純化精子DNA，從而達(dá)到使上皮細(xì)胞和精子細(xì)胞分離的目的。[3]

該方法應(yīng)用廣泛，卻耗時(shí)長(zhǎng)，提取過程中可能過度裂解或裂解不完全，使得精子DNA丟失，在精子含量少、女性成分含量相對(duì)很高的混合檢材中，采用差異裂解法無(wú)法將女性成分完全去除，不能得到完整單一的男性STR分型。所以針對(duì)該方法的改良也較多，國(guó)內(nèi)外研究者先后建立了硅珠法[4]、和DNaseI純化結(jié)合堿性裂解法[5]等分離精子細(xì)胞的方法與此同時(shí)還研發(fā)出了Phase lock GelTM system[6]、DifferexTM system[7]、DNA IQTM system[8]、差異提取試劑盒[9]等商業(yè)化試劑盒。

雖然差異裂解法有時(shí)并不能得到理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但是由于其檢測(cè)成本低，原理簡(jiǎn)單，仍是國(guó)內(nèi)大多數(shù)研究人員處理精液混合斑的主要手段。

2 免疫磁珠分離技術(shù)

免疫磁珠分離技術(shù)是在磁性微珠上通過抗原抗體特異性結(jié)合分離和富集目標(biāo)物的技術(shù)。精子細(xì)胞膜表面有很多蛋白，有些膜蛋白具有精子組織特異性，甚至是人類種屬特異性，并且有較強(qiáng)的的抗原性。[10]篩選出合適精子細(xì)胞表面特異性抗原，制作單克隆抗體，與磁珠偶聯(lián)，利用抗原-抗體反應(yīng)通過精子細(xì)胞膜上相應(yīng)的抗原特異性結(jié)合的免疫磁珠定向捕獲精子，進(jìn)而達(dá)到分離精子的目的。

免疫磁珠法所用儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，適用于各種條件的實(shí)驗(yàn)室，而且該方法能夠保持被分離細(xì)胞的原有生物學(xué)性狀和功能，能夠在分離同時(shí)進(jìn)行純化、富集。[11]雖然免疫磁珠法具有操作簡(jiǎn)便、分離效率高且可重復(fù)性好等明顯的優(yōu)勢(shì)，但是在實(shí)際應(yīng)用中，常由于精子細(xì)胞膜表面抗原的降解，無(wú)法進(jìn)行直接分離的情況，還需要結(jié)合其他技術(shù)輔助完成精子細(xì)胞的分離。

3 顯微操作法

顯微操作法分離精子細(xì)胞是在倒置顯微鏡的觀察視野下，通過顯微操作儀，利用精子細(xì)胞的特殊形態(tài)，在混合細(xì)胞中分離與富集精細(xì)胞。

該方法可有效地獲得單個(gè)細(xì)胞，尤其對(duì)微量檢材分型成功率高。但對(duì)于輪奸案中的混合精斑，由于存在不同男性的精子細(xì)胞，且不能通過顯微鏡觀察分辨，所以往往會(huì)出現(xiàn)分型疊加的結(jié)果。而且需要一定的經(jīng)驗(yàn)和技巧，顯微操作過程復(fù)雜；對(duì)微量精子甚至單個(gè)精子進(jìn)行DNA分型時(shí)，由于模板量少，容易產(chǎn)生擴(kuò)增不平衡、等位基因丟失或增加等問題，影響后續(xù)的DNA結(jié)果分析。[12]

4 激光捕獲顯微切割技術(shù)

激光捕獲顯微切割技術(shù)（laser capture mierodisseetion， LCM）是一種可以分離單個(gè)細(xì)胞的新技術(shù)，由于它能夠在顯微鏡的直視下自動(dòng)化的迅速準(zhǔn)確的選取單一細(xì)胞亞群或單個(gè)細(xì)胞[13]，利用紅外激光捕獲技術(shù)和紫外切割技術(shù)將選取的目標(biāo)細(xì)胞從混合細(xì)胞中分離出來，從而為后續(xù)的研究工作奠定基礎(chǔ)。LCM基本原理是通過紅外激光脈沖激活熱塑膜，激光脈沖瞬間的高能量使目標(biāo)細(xì)胞與轉(zhuǎn)運(yùn)膜在光斑處的粘合凝固，從而有選擇性地將目標(biāo)細(xì)胞或組織碎片分離出目標(biāo)樣品 [14]。

近年來運(yùn)用單純LCM技術(shù)，在實(shí)際檢案中也獲得了較滿意的效果[15]，但對(duì)于一些精子形態(tài)很難辨認(rèn)的檢材，例如陳舊檢材，該方法仍有一定的局限性。所以LCM聯(lián)合免疫熒光染色技術(shù)或LCM聯(lián)合FISH技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，這兩種方法避免了反復(fù)的載體轉(zhuǎn)移與洗脫過程，從而減少了精子細(xì)胞的損失，所以適用微量等疑難檢材的分析處理。但這兩種方法的設(shè)備昂貴，對(duì)操作人員要求較高；常因存在女性DNA粘附于精子細(xì)胞頭部或者轉(zhuǎn)移膜的情況，獲得混合分型，不能達(dá)到分離出單一精子DNA的目的 [12]。

5 微流控芯片

微流控芯片（microfluidic chip）是將采集樣品、前處理、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等功能集中在一小塊芯片上進(jìn)行分析，該技術(shù)以生物化學(xué)和分析化學(xué)為基礎(chǔ)，以微機(jī)電加工技術(shù)為依托，以微管道網(wǎng)絡(luò)為結(jié)構(gòu)特征的綜合類技術(shù) [16]。

該方法具有高速、高效、高能量、集成化、低樣品與試劑消耗、易在片集成多用途功能組件等特點(diǎn)，且芯片的體積小、重量輕、便于攜帶、可進(jìn)行多通量操作，非常有利于實(shí)現(xiàn)精子細(xì)胞的高通量、自動(dòng)化分離。目前技術(shù)研究主要集中在微流控芯片上以機(jī)械操控法[17]、雙向電泳[18]及聲波差異提取法[19]等方向來分離精液混合斑，但由于芯片技術(shù)還是一門新興學(xué)科，技術(shù)發(fā)展中還存在很多的不成熟，還需要進(jìn)一步的改進(jìn)與完善。

6 流式細(xì)胞術(shù)

流式細(xì)胞術(shù) （Flow cytometry， FCM）是集激光技術(shù)、電子生物技術(shù)、光電測(cè)量技術(shù)、電子計(jì)算機(jī)技術(shù)、熒光化學(xué)技術(shù)以及單克隆抗體技術(shù)于一體的高科技技術(shù)。[20]FCM是將熒光素分子與制備好的具有精子細(xì)胞表面特異性抗原的單克隆抗體偶聯(lián)后，在含有精子細(xì)胞的混合液中孵育，制成帶有免疫熒光標(biāo)記的單細(xì)胞懸液，在細(xì)胞線性排列通過時(shí)，檢測(cè)器將接收的被熒光染色的細(xì)胞所產(chǎn)生的熒光激發(fā)信號(hào)，與電荷及高壓靜電場(chǎng)聯(lián)合作用，實(shí)現(xiàn)多參數(shù)、快速定量的分析和分選。[21]

FCM能夠?qū)⒍喾N細(xì)胞的逐一分離，實(shí)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞水平的研究，對(duì)精子細(xì)胞相對(duì)含量極少的檢材有較高的靈敏度和精準(zhǔn)度，同時(shí)可以加入其它參數(shù)的測(cè)定，為后續(xù)的研究提供基礎(chǔ)。但與差異裂解法相比FCM同樣存在，對(duì)設(shè)備和操作人員的要求高的缺點(diǎn)，不利于推廣使用。

7 總結(jié)與展望

綜上所述，雖然國(guó)內(nèi)外研究人員依據(jù)上皮細(xì)胞與精子細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、物理學(xué)、分子生物學(xué)等存在的差異，建立了多種分離精液混合斑的方法，但目前仍沒有一種方法能夠既易操作又可以有效、快速得分離精子細(xì)胞。目前隨著科技的不斷進(jìn)步，為解決這一難題也提出了許多新的思路，也許不久的將來精液混合斑的分離將不再是個(gè)難題。

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作者簡(jiǎn)介：王婧茹（1988），女，寧夏人，本科，法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)物證檢驗(yàn)工作。