胡曉苗，張丹俊，戴銀，趙瑞宏，潘孝成，周學(xué)利，侯宏艷，沈?qū)W懷，朱傳明

摘要 [目的]鑒定引起病死鵝肝臟表面出現(xiàn)大量針尖大、白色壞死點(diǎn)的致病菌。[方法]取肝涂片鏡檢，然后進(jìn)行瑞氏-吉姆薩染色。用普通肉湯培養(yǎng)基和鮮血培養(yǎng)基進(jìn)行分離和純化，然后用巴氏桿菌特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至PMD18-T載體上，送至生物公司進(jìn)行測序。[結(jié)果]序列同源性分析表明，分離菌與多殺性禽巴氏桿菌的相似性為99%，結(jié)合生化試驗結(jié)果確定其為多殺性巴氏桿菌。[結(jié)論]研究可為鵝巴氏桿菌病的防治提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞 多殺性巴氏桿菌；分離；鑒定

中圖分類號 S852.61+2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）06-0069-02

Isolation and Identification of Pasteurella multocida in Goose

HU Xiaomiao， ZHANG Danjun， DAI Yin et al （Institute of Animal Husbandry and Veterinary， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei， Anhui 230031）

Abstract [Objective]To identify the pathogen that caused a large number of white necrosis of the needle point in the liver surface of dead geese.[Method]The microscopic examination of liver smear was observed， and WrightGiemsa staining was conducted.After using ordinary broth and blood culture medium for separation and purification， PCR amplification was carried out by Pasteurella multocida specific primers .The purified product was cloned into PMD18T vector ， then sent to the biological company for sequencing. [Result]The similarity of the obtained sequencing result by comparison to Pasteurella multocida was 99%， which was determined as Pasteurella multocida combined with biochemical test results.[Conclusion]The research could provide basis for the prevention and control of pasteurellosis.

Key words Pasteurella multocida；Isolation；Identification

鵝巴氏桿菌病又稱鵝霍亂，是由多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）引起的一種高度接觸性、敗血性傳染病。該病發(fā)病急、死亡快，其發(fā)病率和死亡率由于飼養(yǎng)管理、病原毒力等不同而存在差異。據(jù)不完全統(tǒng)計，發(fā)病率高達(dá)35%，死亡率高達(dá)70%，如果出現(xiàn)混合感染，死亡率可能更高，嚴(yán)重威脅著我國養(yǎng)鵝業(yè)的健康發(fā)展。筆者取疑似感染巴氏桿菌病的病死鵝肝臟作為接種物，接種在普通肉湯培養(yǎng)基和鮮血培養(yǎng)基上進(jìn)行細(xì)菌分離和純化，通過生化試驗鑒定挑選出生化反應(yīng)相符的菌株進(jìn)行保存?zhèn)溆?。根?jù)GenBank已發(fā)布的多殺性巴氏桿菌的16S RNA基因和OmpA基因設(shè)計2對引物[1-3]，通過PCR檢測鑒定是否為致病性巴氏桿菌。

1 材料與方法

1.1 病料 病料來源于安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)臨床診斷中心送檢的鵝肝臟。

1.2 培養(yǎng)基與主要試劑 普通肉湯培養(yǎng)基、鮮血培養(yǎng)基由實(shí)驗室自配；瓊脂糖、Taq Master Mix、DNA Marker 2000，均購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司。

1.3 細(xì)菌的分離與純化 取疑似巴氏桿菌鵝的肝臟接種于普通肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行增菌培養(yǎng)，然后挑取增菌液置于鮮血培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。挑取其中特征性可疑的菌落進(jìn)行二次培養(yǎng)，反復(fù)純化2次，得到其純培養(yǎng)置于4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 染色鏡檢 從鮮血培養(yǎng)基上挑取1株純化后的疑似菌落進(jìn)行涂片，進(jìn)行瑞氏染色鏡檢，并觀察其染色特性和形態(tài)。

1.5 引物的合成 根據(jù)GenBank已發(fā)布的巴氏桿菌的16S RNA和OmpA基因設(shè)計2對引物（表1），引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。利用設(shè)計的2對引物，對菌株進(jìn)行PCR檢測。

1.6 PCR檢測鵝致病性巴氏桿菌16S RNA基因 PCR反應(yīng)體系如下：菌液模板1 μL，Taq Master Mix 10 μL，上、下引物各1 μL，無菌ddH2O補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min。利用1.3%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行觀察，拍照并記錄電泳結(jié)果。

1.7 PCR檢測鵝致病性巴氏桿菌OmpA基因 PCR反應(yīng)體系如下：DNA模板1 μL，Taq Master Mix 10 μL，上、下引物各2 μL，無菌ddH2O補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。利用1.3%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行觀察，拍照并記錄電泳結(jié)果。

1.8 PCR產(chǎn)物的純化、克隆與序列分析 對16S RNA基因和OmpA基因的PCR產(chǎn)物按照DNA回收試劑盒說明書進(jìn)行回收目的片段。然后，進(jìn)行T載體連接，10 μL體系包括PMD18-T 0.5 μL、目的基因4.5 μL，solution I 5 μL，16 ℃水浴30 min。最后，轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，并涂布在含抗生素氨芐的培養(yǎng)基上置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜，取經(jīng)PCR檢測出目的條帶的菌落進(jìn)行測序。測序工作由合肥安博森生物科技有限公司完成，對測序基因序列進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病理剖檢 病鵝剖檢呈典型敗血性變化，肝臟表面出現(xiàn)大量針尖大的白色壞死點(diǎn)（圖1）。

2.2 細(xì)菌分離與鑒定 接種于鮮血培養(yǎng)基上，呈現(xiàn)出半透明的灰白色、露珠樣、微微隆起且表面光滑、邊緣整齊的小菌落[2]。從鮮血培養(yǎng)基上挑取其中單一的典型菌落進(jìn)行瑞士染色，通過鏡檢可見兩極著色的短桿菌。

2.3 對巴氏桿菌進(jìn)行16S RNA基因和OmpA基因檢測 16S RNA基因和OmpA基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為862和201 bp，與目的片段大小一致，檢測結(jié)果如圖2所示。

2.4 同源性分析 對16S RNA基因序列進(jìn)行Blast對比，其與多殺性巴氏桿菌CP019081.1、CP007205.1、CP004392.1的同源性最高，達(dá)到99%。對OmpA基因序列進(jìn)行Blast對比，其與多殺性巴氏桿菌CP020403.1、CP019081.1、KX161895.1的同源性最高，達(dá)到99%。因此，可確定分離菌為多殺性巴氏桿菌。

2.5 生化試驗結(jié)果 對病料中分離出的細(xì)菌按照常規(guī)方法進(jìn)行了生化鑒定，結(jié)果見表2。

3 討論

此鑒定方法應(yīng)用于葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌、禽流感等時均不能擴(kuò)增出目的片段.卻可從禽多殺性巴氏桿菌擴(kuò)增出862和201 bp大小的特異性片段[4-6]，表明引物只對禽多殺性巴氏桿菌有特異性，敏感性強(qiáng)，基本不會出現(xiàn)雜菌干擾。生化鑒定是進(jìn)行細(xì)菌鑒定分型的標(biāo)準(zhǔn)方法，但該方法所需要的時間過長，操作也相對繁瑣，且所需要的儀器較多，耗費(fèi)大量的人力和物力。應(yīng)用PCR檢測技術(shù)不僅可對純培養(yǎng)物進(jìn)行檢測，又可直接從病料的初次培養(yǎng)物中進(jìn)行檢測，不必進(jìn)行純化培養(yǎng)，還可從病料組織中直接提取DNA，操作簡單，大大縮短檢測所需時間，能達(dá)到準(zhǔn)確、快速診斷的目的，對于及早采取有效的防治措施具有重要的實(shí)踐意義[7-9]。

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