羅鑫 張海燕 劉明元

摘要 綜述了土壤微生物多樣性常用的研究方法，闡述了稻田土壤微生物多樣性的影響因素以及目前研究進(jìn)展，并對(duì)未來(lái)的研究方向進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞 稻田土壤；微生物群落；多樣性

中圖分類號(hào) S154.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）21-0042-02

Abstract This paper introduced the commonly used research methods of soil microbial diversity； it also summarized the recent progress in studies of paddy soil microbial communities and discussed the directions of future research.

Key words Paddy soil；Microbial community；Diversity

水稻是我國(guó)第一大糧食作物，稻田土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定是保障水稻健康生長(zhǎng)、提高產(chǎn)量的基礎(chǔ)，對(duì)水稻耕種的持續(xù)發(fā)展具有重要作用。1 g土壤中微生物約有100億個(gè)[1]，包括原生動(dòng)物、放線菌、真菌和細(xì)菌等[2]，這些微生物群落雖然渺小，但在生態(tài)系統(tǒng)中起著不可忽視的作用，土壤中有機(jī)質(zhì)分解、養(yǎng)分運(yùn)轉(zhuǎn)等均得益于微生物群落的作用，并有研究表明它們的存在可以降低植物病害并促進(jìn)農(nóng)業(yè)的增產(chǎn)[3]。然而，耕種方式的改變和農(nóng)藥的頻繁使用影響稻田土壤微生物群落的多樣性，進(jìn)而對(duì)土壤氮磷含量以及土壤環(huán)境質(zhì)量產(chǎn)生影響。近年來(lái)有關(guān)水稻田土壤微生物群落多樣性及其在生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮的作用已有較多研究。筆者綜述了土壤微生物群落多樣性的研究方法，闡述了稻田土壤微生物多樣性的影響因素，并對(duì)未來(lái)的研究方向進(jìn)行了展望。

1 稻田土壤微生物多樣性的研究方法

土壤微生物多樣性的研究對(duì)象包括土壤生態(tài)系統(tǒng)中所有微生物種類、擁有的基因及微生物與環(huán)境之間的多樣化程度[4]。長(zhǎng)期以來(lái)，關(guān)于微生物多樣性的研究層次問(wèn)題一直存在多種解釋，普遍認(rèn)為應(yīng)從3個(gè)層次上綜合表述，即物種多樣性、遺傳物質(zhì)多樣性和生理功能多樣性。土壤微生物的物種多樣性是指土壤生態(tài)系統(tǒng)中微生物的物種豐度，遺傳多樣性是指物種所具有的各類遺傳物質(zhì)和信息，分別是微生物多樣性的直接表現(xiàn)形式和本質(zhì)反映[4]。功能多樣性是指土壤微生物所具備的能力及實(shí)現(xiàn)過(guò)程，土壤中有機(jī)物的分解利用、氮磷等營(yíng)養(yǎng)元素釋放和傳遞等都屬于此范疇[4]。微生物多樣性的研究方法可以分為兩大類：一類是傳統(tǒng)的培養(yǎng)和分離方法，主要通過(guò)稀釋和固體培養(yǎng)基實(shí)現(xiàn)微生物的分離；另一類是生物指示分子鑒定法，通過(guò)磷脂脂肪酸、RNA或DNA等指示分子的特征來(lái)分析微生物生態(tài)多樣性[5]。

傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法是利用含各種營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基對(duì)微生物進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)微生物在固體培養(yǎng)基上形成的菌落形態(tài)不同來(lái)區(qū)分種類，根據(jù)菌落計(jì)數(shù)來(lái)統(tǒng)計(jì)物種數(shù)量。此種方法在現(xiàn)代生物技術(shù)未興起時(shí)對(duì)土壤微生物起到了初略了解的作用，然而其缺點(diǎn)非常明顯，培養(yǎng)條件的不同對(duì)結(jié)果的影響很大，工作量繁重，并不能真實(shí)地反映土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性，因?yàn)榄h(huán)境中僅有1%～10%的微生物[6-7]可以被培養(yǎng)，即傳統(tǒng)培養(yǎng)法反映的僅是土壤中能在特定培養(yǎng)條件下生存的這部分微生物的信息，因此傳統(tǒng)培養(yǎng)法很少用來(lái)反映土壤微生物多樣性。

雖然傳統(tǒng)培養(yǎng)法在微生物多樣性方面沒(méi)有優(yōu)勢(shì)，但在某些特定功能微生物的馴化和篩選方面具有不可替代的作用而被廣泛應(yīng)用。通過(guò)設(shè)定微生物的培養(yǎng)環(huán)境，在培養(yǎng)過(guò)程中將不需要的菌類淘汰，得到具有一定功能的菌類，這就是微生物的馴化和篩選。王曉等[8]利用傳統(tǒng)培養(yǎng)法從土壤中篩選出一株能夠降解毒死蜱的細(xì)菌，純化后鑒定為側(cè)芽孢桿菌（Bacillus latersprorus），并在純培養(yǎng)條件下對(duì)該菌降解能力進(jìn)行研究。顧挺等[9]等利用傳統(tǒng)培養(yǎng)法從稻田土壤中篩選出纖維素降解菌，以期對(duì)秸稈降解提供幫助。

在分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展的帶動(dòng)下，微生物研究技術(shù)得到了很大提升，能夠從分子水平上揭示土壤微生物種類和遺傳物質(zhì)多樣性，磷脂脂肪酸法（phospholipid fatty acid， PLFA）、基于PCR的分子生物學(xué)技術(shù)克服了傳統(tǒng)分離方法的局限性，能夠較全面地反映微生物的多樣性而被廣泛應(yīng)用于土壤微生物群落多樣性研究中。PLFA技術(shù)是利用細(xì)胞膜磷脂脂肪酸的種類和數(shù)量來(lái)辨別微生物多樣性的方法。磷脂脂肪酸是細(xì)胞膜磷脂的重要組成成分，不同生物的細(xì)胞膜含有特異的磷脂以及磷脂脂肪酸[10-11]，PLFA在微生物體內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性，但微生物死后能夠迅速被降解[10]，因此通過(guò)分析土壤中PLFA的種類和含量，可以反映特定微生物群落的存在及豐度。PCR-DGGE技術(shù)是在對(duì)土壤中微生物DNA提取的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，通過(guò)DNA序列擴(kuò)增、梯度電泳等技術(shù)將不同DNA以條帶的形式區(qū)分開(kāi)，以檢測(cè)到條帶的數(shù)量和豐度來(lái)表示群落結(jié)構(gòu)和多樣性。林黎等[12]利用PLFA技術(shù)對(duì)崇明島稻田不同圍墾年代的微生物多樣性進(jìn)行研究，通過(guò)比較總微生物、總細(xì)菌、革蘭氏陽(yáng)性、陰性菌的磷脂脂肪酸含量，發(fā)現(xiàn)微生物數(shù)量與土壤營(yíng)養(yǎng)含量呈正相關(guān)。宋亞娜等[13]運(yùn)用PCR-DGGE技術(shù)結(jié)合DNA測(cè)序分析氮肥對(duì)稻田nirS型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和豐度的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)施用氮肥后群落多樣性指數(shù)提高。

然而，PLFA法和PCR-DGGE技術(shù)并不是萬(wàn)能的，在分析微生物多樣性時(shí)并不能作為一個(gè)絕對(duì)指標(biāo)。PLFA法也有自身的局限性，不同屬甚至不同科微生物的脂肪酸圖譜可能發(fā)生重疊，因此該方法最多僅能鑒定到微生物的屬，不能詳細(xì)地確定微生物的具體種。PCR-DGGE技術(shù)分析的主要對(duì)象是菌落數(shù)量達(dá)到一定優(yōu)勢(shì)的種群[14]，樣品DNA提取不完全、PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的誤差，都會(huì)影響土壤微生物群落分析結(jié)果。另外，盡管這些方法提供了大量的遺傳物質(zhì)信息，但不能提供充足的微生物功能方面的信息，很難利用這些信息將微生物群落與其功能聯(lián)系起來(lái)。

BIOLOG平板法是一種從微生物利用碳源多樣性的角度研究其功能多樣性的方法，它通過(guò)微生物對(duì)BIOLOG板中95種不同單一碳源利用能力來(lái)評(píng)價(jià)某一樣品微生物群落功能多樣性。章家恩等[15]利用BIOLOG平板法研究了放鴨對(duì)稻田土壤微生物群落功能多樣性的影響，結(jié)果表明稻田土壤微生物群落的碳源利用能力提高。近年來(lái)，還有一些新技術(shù)被應(yīng)用于土壤微生物多樣性的研究，如微生物放射技術(shù)（microradioautography）、穩(wěn)定性同位素技術(shù)（stable isotope probing， SIP）、微生物功能基因芯片技術(shù)（functional gene microarray）等[16]，他們各有自己的優(yōu)點(diǎn)和缺陷，因此，可以結(jié)合多種方法來(lái)研究稻田土壤微生物多樣性以及生物群落功能多樣性。

2 稻田土壤微生物多樣性的影響因素

1 g農(nóng)田土壤中含有的細(xì)菌達(dá)數(shù)百萬(wàn)，真菌和原生動(dòng)物也達(dá)幾十萬(wàn)，水稻田土壤含水量大，根系密集，更有利于微生物的棲息，造成微生物多樣性非常豐富。土壤微生物多樣性與土壤環(huán)境密切相關(guān)，不同的地區(qū)和氣候，不同的耕種方式都會(huì)影響微生物組成。羅青等[17]對(duì)福建省稻田土壤微生物多樣性進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)和同一地區(qū)表土與根際土中細(xì)菌和固氮菌的組成有較大差異，且固氮菌的地區(qū)多樣性更明顯。影響稻田土壤微生物多樣性的因素很多，可分為自然因素和人為因素兩大類，自然因素有土壤類型、植被形態(tài)、氣候和水分等。人為因素主要是人類在耕種時(shí)部分改變了土壤性質(zhì)而影響微生物多樣性，主要包括施肥、農(nóng)藥的應(yīng)用、耕作方式等。

2.1 耕種措施對(duì)稻田土壤微生物多樣性的影響

耕種措施能夠直接改變土壤物理和化學(xué)性質(zhì)，從而明顯改變土壤微生物群落多樣性。郭梨錦等[18]采用PLFA技術(shù)對(duì)稻田表層土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行研究，結(jié)果得到21種不同的磷脂脂肪酸，表明秸稈還田有利于增加表層土壤微生物的種類和數(shù)量以及短期免耕能夠改變微生物群落結(jié)構(gòu)。卜元卿等[19]直接提取水稻土和紅壤細(xì)菌總DNA，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析，結(jié)果顯示稻秸原位還田后的土壤樣品DGGE條帶增多，說(shuō)明稻秸還田能夠增加土壤微生物群落的多樣性。陳曉娟等[20]采用PLFA法研究不同耕種方式對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明水稻田中真菌及革氏陰性菌的相對(duì)含量明顯高于其他地，水旱輪作地中革氏陽(yáng)性菌的相對(duì)含量也偏高。稻田土壤微生物多樣性與水稻根際的有機(jī)物豐富程度有很大關(guān)系，秸稈還田為微生物提供了豐富的有機(jī)質(zhì)，免耕或少耕減少了土壤中穩(wěn)態(tài)微生物團(tuán)體被破壞的概率，從而可以提高微生物群落多樣性。

2.2 施肥對(duì)稻田土壤微生物多樣性的影響

水稻的根際效應(yīng)與水稻生長(zhǎng)有密切關(guān)系，肥料的施入會(huì)改變土壤組成和水稻根際環(huán)境，從而直接或間接地改變稻田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。肥料為土壤中增添了大量可利用碳源，大大刺激了土壤中微生物的生長(zhǎng)，從而提高其多樣性。袁紅朝等[21]采用PCR和16S rRNA測(cè)序技術(shù)，研究3種長(zhǎng)期施肥制度對(duì)湖南某地稻田土壤細(xì)菌和古菌群落結(jié)構(gòu)及數(shù)量的影響，結(jié)果表明土壤中的細(xì)菌主要為變形菌、酸桿菌、綠彎菌，古菌則為泉古菌和廣古菌，施肥增加了群落多樣性。

2.3 農(nóng)藥對(duì)稻田土壤微生物多樣性的影響

為鏟除蟲(chóng)害病害保障水稻產(chǎn)量，農(nóng)藥是必不可少的，然而農(nóng)藥的利用率低，大部分農(nóng)藥流失在環(huán)境中，造成環(huán)境污染和生態(tài)破壞，也很大程度上影響水稻田土壤微生物多樣性。農(nóng)藥的影響也因農(nóng)藥的種類、濃度不同而不同，研究表明高濃度殺菌劑、除草劑、殺蟲(chóng)劑均能抑制微生物活性，引起群落結(jié)構(gòu)變化，破壞生態(tài)平衡，而低濃度農(nóng)藥則有一定刺激作用，各種農(nóng)藥中殺菌劑對(duì)微生物數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)影響較大[5]。張?chǎng)┑萚22]研究了不同濃度農(nóng)藥（芐嘧磺?。?duì)水稻田土壤微生物群落功能多樣性的影響，結(jié)果顯示高濃度會(huì)降低微生物的碳源利用能力，低濃度表現(xiàn)為促進(jìn)作用，隨時(shí)間延長(zhǎng)抑制和促進(jìn)作用逐步消失。張仕穎等[23]研究了丁草胺對(duì)水稻田真菌、好氧細(xì)菌、放線菌、氮循環(huán)細(xì)菌等微生物的影響，結(jié)果表明，丁草胺可以降低水稻田微生物群落的碳源利用能力。

3 結(jié)論與展望

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組分，在土壤質(zhì)量和植物健康方面發(fā)揮著重要作用。豐富多樣的微生物種類不僅是維持稻田土壤生態(tài)的重要因素，更是提高水稻產(chǎn)量和質(zhì)量的重要保障。土壤微生物與其所處的環(huán)境相互影響，環(huán)境條件的改變可以影響微生物的多樣性群落結(jié)構(gòu)，微生物群落形成規(guī)模后同樣可以一定程度地改變環(huán)境。探索稻田土壤微生物種群結(jié)構(gòu)、分布規(guī)律，研究各種因素對(duì)其產(chǎn)生的影響，對(duì)深入了解各種養(yǎng)分在水稻土壤體系中的傳遞與轉(zhuǎn)化、解決農(nóng)藥殘留造成的稻米安全問(wèn)題和環(huán)境污染等具有重要意義。

目前，對(duì)于水稻土壤微生物多樣性的研究主要集中在兩方面，一方面是人為活動(dòng)對(duì)水稻土壤微生物多樣性的影響，包括施肥、灌溉、農(nóng)藥應(yīng)用等；另一方面是某些功能微生物多樣性的研究，如與碳循環(huán)、氮循環(huán)、鐵循環(huán)等相關(guān)的微生物。另外，利用分子生物學(xué)技術(shù)表征某特定地區(qū)土壤微生物多樣性方面也有較多研究。而對(duì)于水稻不同生長(zhǎng)時(shí)期土壤中優(yōu)勢(shì)微生物的特征，微生物在降解殘留農(nóng)藥的作用機(jī)理，土壤微生物群落多樣性與其功能多樣性的聯(lián)系等方面的研究較少，成為今后稻田土壤微生物群落的研究方向。

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