饒 靜,李春揚,張曉磊*,王晨慧,尹建軍,宋全厚

(1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院,北京 100015；2.國家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心,北京 100015)

以蘋果汁或蘋果濃縮汁為原料,發(fā)酵成蘋果酒,然后接入醋酸菌最終發(fā)酵成蘋果醋［1］。蘋果醋優(yōu)于傳統(tǒng)食醋,兼有水果和食醋的營養(yǎng)保健功能,集營養(yǎng)、保健、食療等功能為一體,其在調(diào)節(jié)新陳代謝、促進血液循環(huán)、軟化血管、降低血脂、控制膽固醇水平、抗氧化性等醫(yī)療保健方面都有較好表現(xiàn),消費人群也正在逐漸擴大［2-3］。有機酸作為蘋果醋的主要活性成分之一,在國家標準GB/T 30884—2014《蘋果醋飲料》中對其種類、含量也有明確的規(guī)定,因此準確測定有機酸的種類和含量,對于優(yōu)化蘋果醋發(fā)酵工藝、提高蘋果醋的品質(zhì)具有十分重要的意義。

已報道對有機酸測定的方法很多,包括電位滴定法［4］、分光光度法［5］、離子色譜法［6-7］、氣相色譜法［8-9］、高效液相色譜法［10-12］等。上述方法中,液相色譜法最為靈敏、準確而得到廣泛運用。本研究通過優(yōu)化反相C18柱的色譜條件和前處理條件,建立可同時分離測定17種有機酸的高效液相色譜方法,并對蘋果醋及其生產(chǎn)原料濃縮蘋果汁、蘋果酒中的有機酸含量進行分析,利用統(tǒng)計分析手段探尋蘋果醋原輔料中有機酸分布的規(guī)律性,以期為企業(yè)調(diào)整工藝和質(zhì)量控制提供一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和分析手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標準品：草酸、酒石酸、奎寧酸、甲酸、丙酮酸、蘋果酸、丙二酸、莽草酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、馬來酸、富馬酸、琥珀酸、反烏頭酸、丙酸(純度≥98%)：美國Sigma公司；蘋果醋、濃縮蘋果汁和蘋果酒樣品：由企業(yè)提供；甲醇(色譜純)：美國Baker公司；磷酸氫二銨(分析純)：天津市福晨化學試劑廠；磷酸氫二鉀、磷酸二氫銨、偏磷酸和磷酸(均為分析純)：北京化學試劑公司；實驗用水為Milli-Q超純水；BNWBOND SAX SPE柱(500 mg/6 mL)和BNWBOND LC-C18SPE(500 mg/6 mL)柱、0.22μm尼龍有機濾膜：上海安譜實驗科技股份有限公司；Cleanert NH2-SPE柱(500 mg/6 mL)：天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters液相色譜儀-2487UVD紫外檢測器：美國Waters公司；Milli-QReference超純水發(fā)生器：美國Millipore公司；AL204-IC萬分之一天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

分別配制10 mg/mL的草酸、酒石酸、奎寧酸、甲酸、丙酮酸、蘋果酸、丙二酸、莽草酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、馬來酸、富馬酸、琥珀酸、反烏頭酸、丙酸標準儲備液,于4℃冰箱中保存,使用時根據(jù)需要用流動相逐級稀釋成適當濃度的標準混合工作溶液。

1.3.2 樣品前處理方法

蘋果醋：取一定量樣品,流動相稀釋10倍后過膜備用。

濃縮蘋果汁和蘋果酒：將C18小柱依次用甲醇、去離子水活化平衡,取樣品2 mL以1 mL/min流速流經(jīng)C18固相萃取預(yù)柱除去色素等干擾物,收集流出液,流動相定容至10mL,過膜備用。

1.3.3 色譜條件

InertsilRODS-3色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)；流動相為0.01 mol/L(NH4)2HPO4,pH 2.45,流速：0.5 mL/min；紫外檢測波長210 nm,柱溫30℃,進樣量10μL。

1.3.4 測定條件優(yōu)化

考察不同的流動相(磷酸二氫銨、磷酸氫二銨、偏磷酸和磷酸氫二鉀)、不同pH(pH 2.30、pH2.45、pH 2.70、pH 3.00和pH 3.50)的流動相、不同固相萃取柱對測定結(jié)果的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相的選擇

在液相色譜的分離過程中,有機酸分子依靠在兩相中分配系數(shù)不同實現(xiàn)分離。但因有機酸極性較大,流動相中水的比例很高,常發(fā)生酸的解離。為使有機酸盡可能以分子形式存在,一般使用酸性流動相來抑制有機酸的解離。黃桂穎等［13］比較了不同濃度的磷酸二氫銨、硫酸、磷酸和偏磷酸對有機酸分離效果的影響,發(fā)現(xiàn)以偏磷酸作為流動相添加劑時分離效果最佳；高海燕等［14］在以磷酸氫二鉀為緩沖鹽,實現(xiàn)了11種有機酸(純草酸、酒石酸、奎寧酸、蘋果酸、莽草酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、富馬酸、琥珀酸)的良好分離；王琳等［15］在流動相中添加磷酸氫二鈉,對黃酒中的7種有機酸(草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸)進行了分離測定,也取得了較好的結(jié)果。

本實驗在上述文獻方法的基礎(chǔ)上,實際比較了不同濃度的磷酸二氫銨、磷酸氫二銨、偏磷酸和磷酸氫二鉀對17種有機酸分離效果的影響,最終確定0.01mol/L磷酸氫二銨作為本方法的流動相條件。

2.2 pH值的選擇

由于所選取的17種有機酸其pKa值跨度范圍較大,各組分的保留時間對流動相的pH值非常敏感,這給色譜分離造成了一定的困難。通過優(yōu)化流動相的pH值條件,以期使17種有機酸在流動相中均以一種形式存在,達到最佳的分離定量效果?？紤]到一般色譜柱要求,使用的流動相pH值范圍2≤pH≤9,在分離測定一元弱酸時,流動相緩沖液的pH值范圍應(yīng)為2≤pH≤pKa-2；如果弱酸的pKa≤4,常需要利用酸的共軛堿測定其含量,則流動相緩沖液pH值范圍應(yīng)為pKa+2≤pH≤9。而針對多元弱酸來說,只要提高流動相緩沖溶液的緩沖容量,按關(guān)系式2≤pH≤pKa1-1選擇流動相pH值,比較能得到滿意的結(jié)果［16］。本實驗依據(jù)各種有機酸的解離常數(shù)pKa,以不同pH值(pH 2.30、pH 2.45、pH 2.70、pH 3.00和pH 3.50)的0.01 mol/L(NH4)2HPO4溶液作為流動相,比較其對有機酸分離效果的影響,結(jié)果見圖1。

由圖1可知,流動相pH值對有機酸的分離影響很大。當pH值為2.30時,乙酸和檸檬水完全不能分開；當pH值為2.70時,甲酸和奎寧酸無法分離,抗壞血酸和乳酸分離度也不理想；當pH值為2.70時,檸檬酸和富馬酸、酒石酸和奎寧酸不能有效分離；當pH值為3.00時,蘋果酸、莽草酸和抗壞血酸未能分離開；當pH值為3.50時,不但蘋果酸、莽草酸和抗壞血酸沒有得到改善,甲酸和奎寧酸也無法分離,最終選擇pH2.45作為最適實驗條件。

2.3 SPE柱條件的優(yōu)化

由于蘋果汁和蘋果酒中存在較多的干擾組分,必需經(jīng)過SPE處理以達到凈化富集的目的。參考文獻方法［17］,比較了BNWBOND LC-C18SPE、Cleanert NH2-SPE和BNWBOND SAX SPE三款固相萃取柱對樣品的凈化效果,結(jié)果見圖2。結(jié)果表明,同一樣品經(jīng)三種萃取柱后分別進樣HPLC分析,Cleanert NH2-SPE和BNWBOND SAX SPE柱對有機酸的保留性不強,部分目標物隨淋洗液流出而損失,回收率低,而BNWBOND LC-C18SPE柱能較好地保留目標物質(zhì),因此選擇BNWBOND LC-C18SPE柱。

圖2 不同固相萃取柱對回收率的影響Fig.2 Effects of different solid phase extraction column on recovery rate

2.4 線性范圍、檢出限和定量限

將17種有機酸的標準儲備液用流動相稀釋成一定濃度的混合標準溶液,并在優(yōu)化的實驗條件下進行分析測定,以目標化合物的峰面積(y)為縱坐標,有機酸質(zhì)量濃度(x,mg/L)為橫坐標繪制標準工作曲線。以S/N=3和S/N=10分別確定各有機酸在樣品中的檢出限(limit of detection,LOD)和定量限(limit of quantitation,LOQ),結(jié)果見表1。

表1 17種有機酸的線性關(guān)系、檢出限(S/N=3)和定量限(S/N=10)Table 1 Linear relationships,limits of detection(S/N=3)and limits of quantification(S/N=10)of the 17 organic acids

由表1可知,除去莽草酸(R2為0.998 7)和乳酸(R2為0.998 3)之外,其他化合物的相關(guān)系數(shù)(R2)均＞0.999,說明各有機酸組分在一定濃度范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系；方法的LOD為0.01～0.50 mg/L,LOQ為0.03～1.67 mg/L,表明所建立的方法靈敏度較高,可對有機酸含量較低的樣品進行檢測。

2.5 回收率及精密度

采用3水平加標方式,對蘋果醋、濃縮蘋果汁和蘋果酒三種不同樣品進行加標回收率試驗,每一加標水平平行測定6次,計算平均回收率結(jié)果見表2。由表2可知,17種有機酸的平均加標回收率為74.3%～107.3%,相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)為2.0%～7.0%。表明該方法各有機酸的回收率較為穩(wěn)定,精密度良好,可以滿足三種不同基質(zhì)樣品中17種有機酸的同時測定。

表2 17種有機酸的加標回收率及相對標準偏差(n=6)Table 2 Adding standard recovery rate and RSD of the 17 organic acids

續(xù)表

2.6 實際樣品分析

按照上述方法,對由企業(yè)提供的蘋果醋、濃縮蘋果汁和蘋果酒三類各5個樣品進行了有機酸含量的檢測,每個樣品重復(fù)3次。17種混合標準品以及三類不同樣品中有機酸分析的液相色譜圖見圖3。

由圖3可知,三類樣品中檢出的有機酸包括酒石酸、蘋果酸、莽草酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸等,但不同樣品之間在有機酸組成及含量上存在明顯差別。濃縮蘋果汁樣品中的有機酸主要以蘋果酸和乳酸的形式存在,其中蘋果酸含量最為豐富(18 g/L左右)；蘋果酒中依然以蘋果酸和乳酸為主,但含量水平比蘋果汁明顯降低。蘋果醋樣品中以乙酸為最主要的有機酸成分(含量高達60 g/L),其次還含有一定量的蘋果酸(1 g/L左右)和琥珀酸(0.5 g/L左右),乳酸未檢出。

利用主成分分析,考察三類樣品中有機酸含量分布的規(guī)律性特點。7種有機酸組分經(jīng)過分析提取了2個主成分,并得到各主成分在不同變量下的載荷矩陣表(表4),載荷系數(shù)絕對值的大小即表明其對相應(yīng)主成分的貢獻率大小。

圖4為各樣品在兩個主成分因子上的得分分布圖,圖中代表不同種類樣品的各點聚集在各自特定的區(qū)域內(nèi),說明蘋果醋和濃縮蘋果汁、蘋果酒在有機酸含量上具有顯著差異。其中,濃縮蘋果汁各點集中分布在X軸的正半軸,與另外兩種樣品有明顯區(qū)別,因為其在主成分因子1代表的蘋果酸(載荷系數(shù)0.976)、乳酸(載荷系數(shù)0.651)、檸檬酸(載荷系數(shù)0.969)組分上有非常高的含量；同為X軸負半軸上的蘋果醋和蘋果酒在Y軸的分布上差異明顯,考察具體數(shù)據(jù),因為兩種產(chǎn)品在主成分因子2中載荷系數(shù)最大的乙酸(載荷系數(shù)-0.948)含量上存在較大差別。

圖3 17種混合標準品以及不同樣品中有機酸分析液相色譜圖Fig.3 Chromatograms of 17 organic acids standard mixtures and different samples analysis by LC

表3 樣品中有機酸的測定結(jié)果(n=3)Table 3 Determination results of organic acids in samples(n=3)mg/L

表4 主成分因子載荷矩陣Table 4 Rotated coefficient matrix of principal component factor

圖4 主成分因子得分圖Fig.4 Score plot of principal component factor

3 結(jié)論

本研究通過優(yōu)化前處理條件和色譜條件,建立了一種能夠同時測定蘋果醋中17種有機酸的高效液相色譜方法。該方法可有效去除雜質(zhì)干擾,且具有快速、便捷、準確性高等優(yōu)點,可用于蘋果醋類產(chǎn)品中有機酸的準確測定。

采用所建立的方法對蘋果醋及其原輔料濃縮蘋果汁、蘋果酒中有機酸的含量特征進行分析發(fā)現(xiàn),原料濃縮蘋果汁中有機酸種類豐富,以蘋果酸最為突出,乳酸和檸檬酸等也具有一定的含量；發(fā)酵成蘋果酒后,有機酸以蘋果酸和乳酸為主要形式；最終產(chǎn)品蘋果醋中,乳酸完全被消耗,蘋果酸含量繼續(xù)下降,有機酸主要以乙酸的形式存在。

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