黃 徽,彭青枝*,周陶鴻

(1.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院,湖北 武漢 430075；2.湖北省食品質(zhì)量安全檢測工程技術(shù)研究中心,湖北 武漢 430075)

鎘(cadmium)是一種重金屬元素,主要以與氧、氯、硫等無機元素形成化合物的形式廣泛分布于自然界中。鎘對生物體內(nèi)臟、腦、骨骼及血液系統(tǒng)均可產(chǎn)生毒害性,經(jīng)實驗顯示,鎘對動物的生殖和發(fā)育系統(tǒng)也會產(chǎn)生影響,被美國毒物管理委員會列為第6位危及人體健康的有毒物質(zhì)［1-2］。鎘在環(huán)境中不能被生物降解,工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)所造成的環(huán)境污染是生物體中鎘的主要來源。1950年代,日本富山縣神通川發(fā)生了著名的“痛痛病”事件［3］,探究日本“痛痛病”的因果關系后,環(huán)境中的鎘與健康的關系日益受到重視。鎘在正常環(huán)境中含量很低,但是易在生物體內(nèi)富集,具有高富集特性的作物如稻米等在正常環(huán)境中也能積累高濃度的鎘［4］,由于鎘易在生物體內(nèi)蓄積且難代謝,因此鎘成為影響食用安全的主要重金屬之一。近年來,我國部分地區(qū)頻繁出現(xiàn)大米鎘超標現(xiàn)象,超標率約在5%～15%［5-7］,對人體健康構(gòu)成了嚴重的威脅,社會各界對之高度關注并設法降低鎘大米的食用風險［8］。

鎘在生物體內(nèi)可以與蛋白質(zhì)、有機酸等結(jié)合成有機鎘形態(tài),也可以以離子態(tài)存在。環(huán)境學和毒理學研究結(jié)果表明,離子態(tài)鎘(Cd2+)的毒性較高,結(jié)合態(tài)和有機態(tài)鎘無毒或毒性非常微弱［9］,通過食物攝入到人體中的重金屬代謝活性和毒害效應與其存在形式有很大關系。林忠寧等［10］通過研究有機鎘染毒對小鼠免疫球蛋白及其亞類水平的影響,發(fā)現(xiàn)無機鎘對體液免疫功能的抑制作用明顯高于有機鎘。若簡單地采用鎘的總含量卻以其離子態(tài)的毒性效應作為鎘毒性評價標準可能會有失偏頗,往往會高估其毒害效應。鎘的形態(tài)差異可以作為具有鎘富集特性的食品如稻米等安全性評價的關鍵點,目前關于稻米中鎘形態(tài)的研究較少。

稻米中的鎘在淀粉、脂肪等成分中含量很低,主要以與蛋白質(zhì)結(jié)合的形態(tài)存在,并且主要與谷氨酸(Glu)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、半胱氨酸(Cys)、纈氨酸(Val)、酪氨酸(Tyr)等氨基酸結(jié)合［11］。查燕等［12］通過葡聚糖凝膠層析法對稻米中鎘形態(tài)進行分析也得出了相似結(jié)論。目前國標GB 2762—2017《食品安全國家標準食品中污染物限量》中規(guī)定稻米中鎘限量為0.2 mg/kg,現(xiàn)行鎘的檢測方法是根據(jù)國標GB 5009.15—2014《食品安全國家標準食品中鎘的測定》中規(guī)定的方法,將大米中各種形態(tài)鎘消解轉(zhuǎn)化成離子態(tài)鎘,該方法得到的測定結(jié)果實際上是大米中總鎘的含量?？傛k含量作為檢測指標不能如實反映其食用安全性,更不能準確地進行風險評估,應該針對各種形態(tài)鎘制定相應的標準限量。

楊紅霞等［13］運用體積排阻-高效液相色譜-電感耦合等離子體-質(zhì)譜(size exclusion-high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry,SEC-HPLC-ICP-MS)聯(lián)用技術(shù)分析了印度芥菜中鎘的存在形態(tài),發(fā)現(xiàn)鎘主要以植物螯合肽(phytochelatin,PC)3-鎘(Cd)、植物螯合肽(PC)2-鎘(Cd)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)-鎘(Cd)及半胱氨酸(cysteine,Cys)-鎘(Cd)這4種有機形態(tài)存在。李彬等［14］采用凝膠色譜-高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法分析了富鎘蕨類植物根系中鎘的總量及其形態(tài)分布。但是目前國內(nèi)外標準中均無測定稻米中離子態(tài)鎘(Cd2+)的方法。本實驗研究建立了稻米中離子態(tài)鎘(Cd2+)的分析方法,并分析了部分抽檢的鎘超標稻米(鎘含量＞0.2 mg/kg)中離子態(tài)鎘(Cd2+)的含量,以期為科學評估稻米中鎘的食用風險,保障我國稻米食用安全提供進一步的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

硝酸(分析純)：德國Merck公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；實驗用水為超純水。

Cd2+標準使用液：將1 000μg/mL Cd2+標準儲備液(國家有色金屬及電子材料分析測試中心)稀釋為10.0μg/mL Cd2+的標準使用液,置于4℃保存?zhèn)溆?由10.0μg/mL Cd2+標準使用液經(jīng)浸提液稀釋成4.0μg/L、8.0μg/L、12.0μg/L、16.0μg/L和20.0μg/L的Cd2+標準系列使用液,使用液現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 儀器與設備

UltiMate3000高效液相色譜儀(配有自動進樣器)：美國DIONEX公司；CS5A陽離子交換色譜柱(4mm×250mm)、CG5A保護柱(4 mm×50 mm)、Icap QC電感耦合等離子體-質(zhì)譜(ICP-MS)儀(配有碰撞反應池,形態(tài)分析全自動處理接口)：美國Thermo Fisher Scientific公司；900T原子吸收光譜儀：美國PE公司；MULTIWAVE PRO微波消解儀、Monowave 450微波萃取儀：奧地利安東帕(中國)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品中總鎘的測定

將稻米磨碎混勻,稱取樣品約0.5 g(精確至0.001 g)于微波消解管中,加10 mL硝酸加蓋放置1 h,于微波消解儀中消解。消解完畢后,將微波消解管放入趕酸器中加熱1～2 h后,然后轉(zhuǎn)移消化液至離心管中,用水少量多次洗滌消化管,洗液合并,定容至50 mL,同時制備空白。用石墨爐原子吸收光譜儀測定試樣及試劑空白中鎘含量［15］。

1.3.2 樣品中無機離子鎘(Cd2+)測定

稱取約1 g(精確至0.001 g)磨碎混勻的稻米樣品于萃取管中,按照料液比1∶20(g∶mL)加入50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH7.20),50℃條件下微波萃取10 min,將溶液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中,重復提取一次,合并提取液,于3 900 r/min離心30 min,上清液用0.45μm的水系微孔濾膜過濾,濾液上HPLC-ICP-MS測定無機離子鎘(Cd2+)含量,其計算公式如下：

式中：C為樣品溶液的質(zhì)量濃度,μg/L；C0為試劑空白溶液的質(zhì)量濃度,μg/L；V為樣品定容體積,mL；m為試樣質(zhì)量,g；X為試樣的無機離子鎘含量,mg/kg。

HPLC-ICP-MS主要工作參數(shù)：射頻功率1 550 W,等離子體氣流速14 L/min,霧化氣流速0.89 L/min,輔助氣流速1.1 L/min,檢測器模擬電壓：-1 825 V,檢測器脈沖電壓：1 100 V,采樣時間8 min；浸提液50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH 7.20)；流動相組成：60 mmol/L草酸+100 mmol/L LiOH,使用前經(jīng)過0.45μm濾膜過濾并超聲脫氣。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd2+分離與檢測

以鎘超標稻米中無機離子鎘(Cd2+)為研究目標,采用CS5A陽離子交換色譜柱(4 mm×250 mm)對稻米樣品提取液中無機離子鎘進行選擇性分離并進行ICP-MS檢測,由于重金屬對陽離子交換樹脂有較強的親和力,選擇弱有機酸草酸與Cd2+形成配合物將其從陽離子交換柱中洗脫出來,為了提高草酸解離度,采用LiOH提高流動相pH值,同時也是由于Li+相對于其他金屬離子對固定相的親和力低的原因。經(jīng)過方法驗證,確定分離Cd2+的最佳流動相組成為60 mmol/L草酸+100 mmol/L LiOH。按1.3.2方法對鎘超標稻米樣品進行處理,提取液中Cd2+用LC-ICP-MS進行檢測,結(jié)果見圖1。由圖1可知,該條件下Cd2+分離良好且無雜峰干擾,Cd2+的保留時間為4.5 min。對于元素形態(tài)研究,實驗過程中需保持樣品中鎘元素的形態(tài)不發(fā)生轉(zhuǎn)化,本研究選取Tris-HCl緩沖溶液(pH7.20)為提取劑。雖然用流動相做提取劑可以保持進樣溶液具有與流動相一致的條件來消除系統(tǒng)峰的干擾［16］。但是本實驗采用的流動相草酸是一種絡合劑,可與Cd2+絡合形成配合物,可能對Cd2+保留洗脫有影響,因此不適合用作提取劑。將Cd2+標準溶液用浸提液逐級稀釋成4.0μg/L,8.0μg/L,12.0μg/L,16.0μg/L和20.0μg/L的標準系列溶液,Cd2+標準系列溶液的分離色譜圖見圖2。以Cd2+標準溶液質(zhì)量濃度(x)為橫坐標,積分強度(y)為縱坐標,擬合標準曲線,回歸方程線性相關系數(shù)R=0.998。

圖1 稻米樣品萃取液中HPLC-ICP-MS分析Cd2+色譜圖Fig.1 Chromatography of Cd 2+in extraction of rice sample analysis by HPLC-ICP-MS

圖2 HPLC-ICP-MS分析Cd2+標準溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of Cd 2+standard solution analysis by HPLC-ICP-MS

2.2 提取條件的選擇

2.2.1 萃取時間的選擇

以稻米樣品為試驗對象,在其他條件一定的情況下,設定微波萃取時間分別為5min、10min、20min、30min、60min、120 min進行提取試驗,樣品中Cd2+提取結(jié)果見表1。由表1可知,提取時間在10 min內(nèi),稻米中離子態(tài)鎘(Cd2+)并未達到提取完全狀態(tài),在10 min后,萃取時間對提取效率影響不明顯(P＞0.05),說明微波能量場可以快速將稻米中的離子態(tài)鎘(Cd2+)釋放出來,故選擇10 min作為樣品萃取時間。

表1 萃取時間對Cd2+提取效率的影響Table 1 Effect of extraction time on Cd 2+extraction efficiency

2.2.2 萃取溫度的選擇

保持其他條件不變,分別在30℃、40℃、50℃、60℃和70℃溫度條件下對稻米樣品進行微波萃取,考察萃取溫度對樣品中Cd2+提取效果,結(jié)果見圖3。由圖3可知,在50℃之前,Cd2+提取量隨溫度的升高而增加,在此之后基本不變,故本實驗選擇50℃作為萃取溫度。

圖3 萃取溫度對Cd 2+提取效率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on Cd 2+extraction efficiency

2.3 精密度和加標回收實驗

2.3.1 精密度實驗

準確稱取3個稻米樣品各5份進行Cd2+含量測定實驗,實驗結(jié)果見表2。由表2可知,3個稻米樣品Cd2+含量平行測定結(jié)果的相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)均＜10%,表明該方法精密度良好。

表2 精密度試驗結(jié)果Table 2 Results of precision experiments

2.3.2 方法加標回收實驗

取2個Cd2+含量已知的稻米樣品分別進行加標回收試驗,測定結(jié)果見表3。由表3可知,試樣中Cd2+加標回收率在85.1%～91.6%,表明該檢測方法準確度高。

表3 加標回收率試驗結(jié)果Table 3 Results of adding standard recovery rate experiments

2.3.3 方法檢出限和定量限

以3倍的信噪比作為依據(jù)來考察本方法檢出限,通過試驗可得本方法檢出限為0.005mg/kg,方法定量限為3倍的方法檢出限即0.015 mg/kg。

2.4 稻米樣品分析

運用本方法測定了監(jiān)督抽檢稻米中部分鎘超標樣品(鎘含量＞0.2 mg/kg)中無機離子態(tài)鎘(Cd2+)和總鎘的含量,并且分析了Cd2+占總鎘含量的比例,結(jié)果見表4。

表4 稻米樣品中無機離子鎘和總鎘的分布狀態(tài)Table 4 Distribution of inorganic cadmium ion and total cadmium in rice samples

由表4可知,29個稻米樣品中離子態(tài)鎘(Cd2+)對總鎘含量占比最低為6.95%,最高為23.50%?？梢姷久字写蟛糠宙k以有機結(jié)合態(tài)存在,結(jié)論進一步說明對稻米開展鎘的風險評估可能需要結(jié)合鎘的形態(tài)分析才會更有說服力。

3 結(jié)論

本實驗采用高效液相色譜-電感耦合等離子體-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-ICP-MS)分析測定稻米樣品中無機離子鎘(Cd2+),方法線性回歸方程相關系數(shù)R=0.998,精密度試驗結(jié)果相對標準偏差(RSD)＜10%,加標回收率85.1%～91.6%,方法檢出限為0.005 mg/kg,表明該方法具有較高的靈敏度和準確度。運用此方法測定了抽檢稻米中部分鎘超標樣品中無機離子鎘(Cd2+)的含量,并分析了其占樣品中總鎘含量比例,發(fā)現(xiàn)稻米中無機離子鎘(Cd2+)含量較低,鎘主要以有機鎘形態(tài)存在,為我國稻米食用安全評價提供重要的參考依據(jù)。

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