李海濤，楊柳，方麗，倪康，石元值*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶樹生物學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310008；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081）

重金屬含量作為茶葉質(zhì)量安全的一類重要指標(biāo)，是茶產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)和出口的重點(diǎn)關(guān)注對象之一。鎘（Cd）作為我國最嚴(yán)重且最易被植物吸收的土壤重金屬污染物，在植物及土壤中的含量一般較低，但該元素進(jìn)入土壤后易被茶樹根系吸收并轉(zhuǎn)移到地上部造成累積，且會通過食物鏈進(jìn)入人體，從而威脅人類健康。當(dāng)鎘累積濃度超過茶樹自身防御反應(yīng)的閾值時(shí)，茶樹的基本生理過程，如光合、蒸騰、代謝、抗氧化等會受到影響，從而抑制茶樹正常生長，影響茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)。為保證農(nóng)副產(chǎn)品的質(zhì)量安全，我國《土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險(xiǎn)管控標(biāo)準(zhǔn)（試行）》（GB 15618—2018）中規(guī)定：pH≤6.5的農(nóng)用地鎘污染風(fēng)險(xiǎn)篩選值為≤0.3 mg·kg，風(fēng)險(xiǎn)管制值為≤1.5 mg·kg，其中鎘為土壤總鎘含量。但現(xiàn)在人們普遍認(rèn)識到，鎘的毒性和對植物的有效性很大程度上取決于其特定的化學(xué)形態(tài)和結(jié)合狀態(tài)。有效態(tài)鎘能更加準(zhǔn)確地反映植物對重金屬的吸收和利用程度，是進(jìn)行土壤重金屬污染評價(jià)的重要參數(shù)。研究表明，用土壤總鎘含量來判斷茶葉鎘污染狀況具有一定的局限性，且與茶葉鎘含量的相關(guān)性較差，而土壤有效態(tài)鎘含量與茶葉鎘含量的相關(guān)性極為顯著。因此，土壤有效態(tài)鎘和總鎘含量結(jié)合可以更加全面準(zhǔn)確地評估茶園土壤鎘污染狀況。

目前，常用的有效態(tài)鎘提取劑類型主要有稀酸溶液（如HCl、HNO等）、絡(luò)合劑（如DTPA、EDTA等）、中性鹽溶液（如CaCl、NHNO等）和緩沖溶液（如NHOAc等）。茶園有效態(tài)鎘提取劑的選擇尚不統(tǒng)一，主要有CaCl、HCl、DTPA 3種。但這3種提取劑是否適用于茶園土壤有效態(tài)鎘的提取還有待驗(yàn)證。此外，提取劑濃度、提取時(shí)間、土液比、振蕩頻率等因素對有效態(tài)鎘提取率的影響也尚未進(jìn)行對比驗(yàn)證。篩選出高效的土壤有效態(tài)鎘提取劑及提取方法，可為準(zhǔn)確判斷茶樹鎘吸收狀況和確保茶葉產(chǎn)品質(zhì)量安全提供技術(shù)支持。因此，本研究以不同地區(qū)茶園土壤和新梢為材料，選擇5種不同提取劑進(jìn)行有效態(tài)鎘提取對比試驗(yàn)，以選出適用于茶園土壤有效態(tài)鎘提取的最佳提取試劑和提取參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集與處理

為使所選樣品鎘含量具有一定的濃度差異，選擇未經(jīng)鎘處理的田間土壤樣品和經(jīng)過鎘處理的盆栽土壤樣品及其對應(yīng)的茶葉新梢（一芽二葉）樣品。采集地點(diǎn)分別為云南省普洱市（=20），浙江省麗水市（=20），中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所嵊州綜合試驗(yàn)基地（=22，包含13個盆栽樣品，其中8個為人工添加Cd（NO）溶液至土壤鎘含量為0.5 mg·kg，3個為人工添加Cd（NO）溶液至土壤鎘含量為0.9 mg·kg，2個為空白對照）。采用土壤和新梢對應(yīng)采樣的方法，在樣品點(diǎn)0~20 cm處選取3個采樣點(diǎn)進(jìn)行取土并混勻，代表該樣點(diǎn)的土壤樣品，新梢樣品為土壤采集點(diǎn)對應(yīng)的茶樹新梢。采集的新梢樣品用自來水和去離子水清洗3遍并晾干，用微波爐短時(shí)間殺青后置于80℃烘箱中烘干，粉碎后密封保存待測。土壤樣品風(fēng)干后除去礫石、植物殘?bào)w，分別過20目篩用于土壤有效態(tài)鎘含量和土壤基本理化性質(zhì)的測定，過100目篩用于土壤總鎘含量的測定。

1.1.2 供試提取劑的配制

0.1 mol·LCaCl溶液：稱取CaCl11.1 g，溶解后加水稀釋至1 L，備用。

0.1 mol·LHCl溶液：吸取HCl（優(yōu)級純）8.3 mL，加水稀釋至1 L，備用。

1 mol·LNHOAc溶液：稱取NHOAc 77.08 g，溶解后加水稀釋至1 L，備用。

1 mol·LMgCl溶液：稱取MgCl·6HO 203.3 g，溶解后加水稀釋至1 L，備用。

0.005 mol·LDTPA溶液：稱取1.967 g DTPA溶于13.3 mL TEA（三乙醇胺）和少量水中，再稱取1.11 g CaCl溶于水中，一并轉(zhuǎn)入1 L容量瓶，加水至約950 mL后用6 mol·LHCl溶液調(diào)節(jié)pH至7.30（6 mol·LHCl用量約為8.5 mL），最后加水定容至1 L，備用。

1.1.3 主要儀器

微波消解儀（MARS6，美國CEM公司），石墨趕酸儀，高分辨電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（HR-ICP-MS，ELEMENTⅡ，美國熱電），搖床，微量超細(xì)球磨機(jī)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 有效態(tài)鎘和總鎘含量測定

土壤有效態(tài)鎘含量測定：稱取過20目篩的土壤樣品5 g于100 mL塑料瓶中，分別加入1.1.2中的5種提取劑各25.0 mL。后置于搖床，搖床參數(shù)設(shè)定為：溫度25℃，振蕩頻率180 r·min，提取時(shí)間2 h。提取完成后先用雙層濾紙過濾，再取少量濾液用親水PTFE針式濾器（孔徑0.22μm）過濾，吸取0.5 mL二次過濾的濾液于15 mL刻度試管中，用超純水稀釋至10 mL，上ICP-MS進(jìn)行測定。

植物樣品總鎘含量測定：稱取0.2 g植物樣品于聚四氟乙烯消解管中，加4 mL HNO、4 mL HF，加蓋后置于微波消解儀中消解（程序設(shè)定為25 min升溫至180℃，并在該溫度下保持20 min），待消解管冷卻后置于趕酸儀（溫度150℃，時(shí)間80 min）趕至消解管中僅剩約1 mL液體，用3%HNO定容至50 mL容量瓶中，上ICP-MS進(jìn)行測定。

土壤樣品總鎘含量測定：稱取0.1 g土壤樣品于聚四氟乙烯消解管中，加6 mL HNO、1 mL HF、2 mL HCl，加蓋后置于微波消解儀中消解（程序設(shè)定為30 min升溫至190℃，并在該溫度下保持30 min），待消解管冷卻后置于趕酸儀（溫度設(shè)定150℃，時(shí)間80 min）趕至消解管中僅剩約1 mL液體，用3%HNO定容至50 mL容量瓶中，上ICP-MS進(jìn)行測定。

1.2.2 提取條件優(yōu)化

根據(jù)1.2.1測定的土壤有效態(tài)鎘含量與茶葉新梢鎘含量的相關(guān)系數(shù)選出最佳提取劑后進(jìn)行提取條件優(yōu)化試驗(yàn)。本試驗(yàn)依次對提取劑濃度（0.5、1、2、4、6、7 mol·L），土液比（1∶2.5、1∶5、1∶10、1∶15），提取時(shí)間（30、60、120、180、240 min）、振蕩頻率（140、180、220、260、300、340 r·min）4個因素進(jìn)行條件優(yōu)化。采用單一變量法，每次僅改變一個提取條件，其他提取條件不變，以單一試驗(yàn)選擇出的最佳提取條件作為下一個提取條件優(yōu)化試驗(yàn)的參數(shù)依據(jù)，每個試驗(yàn)3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)處理和圖表制作采用Microsoft Excel 2016和Prism。使用IBM SPSSStatistics 25進(jìn)行相關(guān)性分析，確定不同提取劑測定的有效態(tài)鎘與新梢鎘的相關(guān)性，確定Pearson相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 土壤和新梢鎘含量評價(jià)

土壤樣品的理化性質(zhì)如表1所示，土壤的pH值介于3.90~5.62，均為酸性土壤。按照有機(jī)質(zhì)含量的高低選擇6個土壤樣品進(jìn)行后續(xù)的提取方法優(yōu)化試驗(yàn)，6個土壤樣品的理化性質(zhì)見表2。

表1 供試土壤基本性質(zhì)和新梢鎘含量Table 1 Basic properties of tested soil and Cd content in new shoots

表2 優(yōu)化試驗(yàn)土壤樣品的基礎(chǔ)性狀Table 2 Basic properties of optimized soil samples

土壤總鎘含量介于0.15~0.94 mg·kg，平均含量為0.26 mg·kg，其中有11個樣品（0.49~0.94 mg·kg）超過《土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險(xiǎn)管控標(biāo)準(zhǔn)（試行）》（GB 15618—2018）中的土壤污染風(fēng)險(xiǎn)篩選值（0.3 mg·kg）。新梢中鎘含量介于0.02~0.35 mg·kg，平均值為0.05 mg·kg，所有樣品均遠(yuǎn)低于《茶葉中鉻、鎘、汞、砷及氟化物限量》（NY 659—2003）中的限量標(biāo)準(zhǔn)（1 mg·kg）。如圖1所示，新梢鎘含量隨土壤總鎘含量的增加而增加，呈現(xiàn)出顯著的正相關(guān)關(guān)系（=0.808 9），該趨勢表明茶園土壤鎘具有一定的生物有效性。

圖1 土壤總鎘與新梢鎘的相關(guān)關(guān)系Figure 1 The correlation between total Cd in soil and Cd in new shoots

2.2 提取劑的選擇

2.2.1 不同提取劑的提取能力差異對比

土壤樣品相同情況下，提取劑類型不同，土壤有效態(tài)鎘的提取率也不同。本研究所用的5種提取劑類型分別為稀酸溶液（0.1 mol·LHCl）、絡(luò)合劑（0.005 mol·LDTPA）、中性鹽溶液（0.1 mol·LCaCl、1 mol·LMgCl）和緩沖溶液（1 mol·LNHOAc）。不同提取劑的提取率采用土壤有效態(tài)鎘含量占土壤總鎘含量的百分比來表征。由表3可知，HCl的提取率最大，NHOAc的提取率最小，HCl的平均提取率約為NHOAc的3倍。提取率從高到低依次為0.1 mol·LHCl>1 mol·LMgCl>0.005 mol·LDTPA>0.1 mol·LCaCl>1 mol·LNHOAc。稀HCl由于自身pH較低、Cl含量高、溶解能力強(qiáng)，易將土壤中碳酸鹽結(jié)合態(tài)等非有效態(tài)鎘提取出來，且HCl增加了酸性土壤中的H含量，使其對金屬陽離子的置換能力增強(qiáng)，因此提取率高，在某些文獻(xiàn)中甚至存在提取率超過土壤總鎘含量的情況。本研究中，0.1 mol·LHCl的有效態(tài)鎘提取率明顯高于其他4種提取劑。中性鹽溶液和緩沖溶液提取的土壤鎘形態(tài)一般為可交換態(tài)和水溶態(tài)兩種有效態(tài)，提取的鎘含量較少，提取率相較其他類型提取液較低。因此本研究中中性鹽溶液和緩沖溶液的提取率最低。此外，Ca作為土壤溶液中的主要陽離子，離子強(qiáng)度與典型的土壤溶液相似，從土壤基質(zhì)中解吸重金屬的競爭能力強(qiáng)于一價(jià)陽離子NH。這解釋了本研究中中性鹽提取劑CaCl的提取率高于緩沖溶液NHOAc的原因。

表3 不同提取劑對土壤有效態(tài)鎘的提取效果對比Table 3 Comparison of extraction effects of different extractants on soil available cadmium

2.2.2 土壤有效態(tài)鎘和新梢鎘的相關(guān)性

圖1和圖2表明，土壤中總鎘和有效態(tài)鎘含量的增加均會引起新梢鎘含量的增加。如圖2所示，5種單一提取劑的土壤有效態(tài)鎘與新梢鎘含量的相關(guān)關(guān)系均達(dá)到極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)大小依次為1 mol·LNHOAc>0.1 mol·LCaCl>0.1 mol·LHCl>1 mol·LMgCl>0.005 mol·LDTPA，有效態(tài)鎘含量與新梢鎘含量的相關(guān)系數(shù)均大于土壤總鎘含量與新梢鎘含量的相關(guān)系數(shù)，且緩沖溶液和中性鹽溶液的相關(guān)系數(shù)優(yōu)于稀酸溶液和絡(luò)合劑。

圖2 土壤有效態(tài)鎘與新梢鎘含量的相關(guān)性分析Figure 2 Correlation analysis of available Cd in soil with Cd content in new shoots

雖然部分文獻(xiàn)中使用DTPA溶液對茶園土壤有效態(tài)鎘進(jìn)行提取，且國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23739—2009中規(guī)定了以DTPA作為土壤有效態(tài)鎘的測定試劑。但DTPA溶液提取有效態(tài)鎘的適用范圍是中性和堿性土壤，當(dāng)應(yīng)用于酸性土壤時(shí)可能會超過土壤溶液自身的緩沖能力，導(dǎo)致鐵錳氧化物和碳酸鹽吸附的重金屬被釋放，而該部分重金屬為非有效態(tài)，因此不能很好地反映酸性土壤中有效態(tài)鎘的含量狀況。HCl溶液屬于強(qiáng)代換劑且pH較低，在進(jìn)行提取時(shí)易將有機(jī)結(jié)合態(tài)和碳酸鹽結(jié)合態(tài)兩種非有效態(tài)鎘提取出來，從而導(dǎo)致其提取的有效態(tài)鎘含量偏高，準(zhǔn)確性差。MgCl溶液中的Mg和Cl分別具有較強(qiáng)的離子交換能力和較弱的絡(luò)合能力，用于有效態(tài)鎘提取時(shí)會造成

土壤pH的降低，從而使碳酸鹽和氧化錳部分溶解，導(dǎo)致可交換態(tài)鎘含量被高估。CaCl溶液對于土壤pH和土壤結(jié)構(gòu)的影響較小，接近土壤自然狀態(tài)下對于重金屬的溶解能力，適用范圍廣。主要是由于中性鹽提取劑對土壤pH、氫氧化物和硅酸鹽的影響較小，并且對土壤顆粒吸附的金屬離子置換能力較強(qiáng)，可提取出土壤中真實(shí)的有效態(tài)鎘含量而非潛在的有效態(tài)鎘含量。NHOAc中的NH可以促進(jìn)交換位離子的置換，形成的金屬絡(luò)合物穩(wěn)定性優(yōu)于Cl形成的金屬絡(luò)合物，有利于交換并減少已絡(luò)合金屬的再吸附和沉淀，且緩沖溶液相較于中性鹽溶液對pH的敏感性更低。因此NHOAc提取劑適用于茶園酸性土壤重金屬有效態(tài)鎘含量的提取研究。

根據(jù)5種提取劑的提取能力差異以及土壤有效態(tài)鎘含量與新梢鎘含量的相關(guān)系數(shù)，選擇NHOAc作為茶園土壤有效態(tài)鎘含量的最佳提取劑，并進(jìn)行后續(xù)的提取條件優(yōu)化試驗(yàn)。NHOAc作為酸性土壤有效態(tài)鎘的提取劑目前已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。如賀靜等發(fā)現(xiàn)6種不同提取劑中NHOAc最適合作為酸性水稻田土壤中有效態(tài)鎘的提取劑，其提取量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差穩(wěn)定性強(qiáng)，有效態(tài)鎘含量與土壤總鎘含量和水稻籽粒中鎘含量呈極顯著相關(guān)。MENZIES等的研究表明，NHOAc可以較好地反映土壤鎘的生物有效性。尹君等的研究表明，以NHOAc溶液作為提取劑，土液比為1∶5、浸提60 min可以較好地表征土壤有效態(tài)鎘含量。因此，我們認(rèn)為NHOAc提取有效態(tài)鎘適用于測定茶園土壤中鎘的生物有效性。

2.3 提取方法的優(yōu)化

2.3.1 提取劑濃度的選擇

提取劑濃度是影響有效態(tài)鎘提取率的重要因素之一。如圖3所示，隨著提取劑濃度的增加，有效態(tài)鎘提取率呈現(xiàn)明顯增長趨勢，但增長幅度隨濃度增加逐漸減小。提取濃度從0.5 mol·L增加到4 mol·L時(shí)，有效態(tài)鎘提取率增長幅度較大，平均相對偏差分別為94.81%、64.77%和29.36%（表4）。由此可知，當(dāng)提取劑濃度低于4 mol·L時(shí)，提取率較低，平均相對偏差變動較大。當(dāng)提取劑濃度在4~6 mol·L之間時(shí)，提取率增長幅度較0.5~4 mol·L之間有所降低，平均相對偏差僅為6.13%。6~7 mol·L時(shí)提取率出現(xiàn)輕微下降，說明此時(shí)有效態(tài)鎘的提取率幾乎不再發(fā)生變化，增加提取劑濃度對提取率影響較小反而還會增加提取成本。因此，選擇6 mol·L作為最佳提取濃度并進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表4 不同提取劑濃度之間的平均相對偏差Table 4 Average relative deviation between different extraction concentrations

圖3 不同提取劑濃度的對比試驗(yàn)Figure 3 Comparative experiment of different extractant concentrations

2.3.2 土液比的選擇

土液比是影響有效態(tài)鎘提取率的因素之一。如圖4所示，當(dāng)土液比從1∶2.5減小到1∶5時(shí)，提取率增加幅度較小，平均相對偏差僅為3.84%（表5）；從1∶5減小到1∶10時(shí)，提取率增長幅度較大，平均相對偏差為12.75%。從1∶10減小到1∶15時(shí)，有效態(tài)鎘提取率出現(xiàn)輕微下降。因此，選擇1∶10作為最佳土液比并進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。隨著土液比減小，提取劑用量增加，土壤中固相狀態(tài)的重金屬離子解吸變成液相狀態(tài)，溶液總體對于鎘離子的交換和絡(luò)合能力增強(qiáng)。但當(dāng)土液比過小時(shí)，重金屬的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在濾液中占比較低，不利于有效態(tài)鎘含量的測定。

表5 不同土液比之間的平均相對偏差Table 5 Average relative deviation between different soil liquid ratios

圖4 不同土液比的對比試驗(yàn)Figure 4 Comparative experiment of different soil liquid ratios

2.3.3 提取時(shí)間的選擇

提取時(shí)間對于有效態(tài)鎘的提取率也具有重要影響。如圖5所示，提取時(shí)間從30 min增加到120 min時(shí)，提取率明顯增加，平均相對偏差分別為14.16%和16.38%（表6）。從120 min增加到240 min時(shí)提取率出現(xiàn)輕微波動，對比120 min和240 min時(shí)的提取率，平均相對偏差僅為-0.66%，原因可能是當(dāng)提取時(shí)間為120 min時(shí)，土壤中的有效態(tài)鎘提取率已經(jīng)或接近平衡狀態(tài)，此時(shí)再增加提取時(shí)間對提取率的影響較小。因此，在既保證測定準(zhǔn)確性又提高工作效率的原則下選擇120 min作為最佳提取時(shí)間并進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表6 不同提取時(shí)間之間的平均相對偏差Table 6 Average relative deviation between different extraction times

圖5 不同提取時(shí)間的對比試驗(yàn)Figure 5 Comparative experiment of different extraction times

2.3.4 振蕩頻率的選擇

振蕩頻率是影響有效態(tài)鎘含量提取的因素之一。如圖6所示，振蕩頻率對有效態(tài)鎘的提取率影響較小。隨著振蕩頻率的增加，提取率的增加幅度較小。振蕩頻率從140 r·min增加到180 r·min，以及從220 r·min增加到300 r·min時(shí)，有效態(tài)鎘提取率出現(xiàn)輕微上升，平均相對偏差分別為4.25%、1.28%和3.24%（表7）。通過對比180 r·min與300 r·min有效態(tài)鎘提取率發(fā)現(xiàn)，平均相對偏差僅為-0.12%，變化較小。在保證有效態(tài)鎘含量測定結(jié)果準(zhǔn)確的同時(shí)，選擇較小的振蕩頻率可以減小對搖床的損耗，所以選擇180 r·min作為有效態(tài)鎘的最佳振蕩頻率。

表7 不同振蕩頻率之間的平均相對偏差Table 7 Average relative deviation between different oscillation frequency

圖6 不同振蕩頻率的對比試驗(yàn)Figure 6 Comparative experiment of different oscillation frequency

3 結(jié)論

（1）稀酸溶液和絡(luò)合劑對茶園土壤的提取能力強(qiáng)，中性鹽溶液和緩沖溶液對茶園土壤的提取能力弱。

（2）5種提取劑有效態(tài)鎘與新梢鎘含量的相關(guān)系數(shù)均大于土壤全鎘，且緩沖溶液和中性鹽溶液的相關(guān)系數(shù)優(yōu)于稀酸溶液和絡(luò)合劑。

（3）提取劑濃度和提取時(shí)間對有效態(tài)鎘提取率的影響較大，土液比和振蕩頻率對有效態(tài)鎘提取率的影響較小。

（4）茶園土壤以NHOAc作為提取劑，提取條件設(shè)定為提取濃度6 mol·L，土液比1∶10，提取時(shí)間120 min，振蕩頻率180 r·min時(shí)的有效態(tài)鎘提取效果最佳。