王思淇，張克強，孔德望，高文萱，韋紅，梁軍鋒，李佳佳，杜連柱*

（1.農業(yè)農村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，天津 300191；2.杭州能源環(huán)境工程有限公司，杭州 310020；3.華標（天津）科技有限責任公司，天津 300392）

厭氧干發(fā)酵具有節(jié)水、低能耗、低污染負荷、反應器體積小以及產氣效率高等優(yōu)勢，是有機固體廢棄物轉化為生物能源的重要手段。2010—2015年，歐洲厭氧干發(fā)酵處理能力增長了50%，處理量占厭氧發(fā)酵總量的35%。在我國，厭氧干發(fā)酵逐漸引起重視，有望成為畜禽養(yǎng)殖糞便、作物秸稈等有機廢棄物處理和資源化利用的主流工藝。厭氧干發(fā)酵按照發(fā)酵溫度可分為中溫（30~40℃）、嗜熱（50~60℃）發(fā)酵，按照發(fā)酵過程可分為一階段、兩階段或多階段消化。LIAO等在厭氧消化反應器中采用改進的攪拌方式，與傳統(tǒng)的低固厭氧消化（總固體含量為4.2%±0.4%）相比，高固厭氧消化（總固體含量為15.7%±0.4%）沼氣產量提高了1.85倍。VOELKEIN等的研究結果表明，55℃、高有機負荷率[揮發(fā)性固體（VS）含量3~4 kg·L·d]下，單位質量VS的日甲烷產率高達405 L·kg。ZHANG等評估餐廚垃圾與園藝廢物的三階段高溫厭氧共消化產氣性能，結果表明三級嗜熱反應器中的平均甲烷產率分別比一級、二級高約45%和31%。

然而，厭氧干發(fā)酵由于有機負荷高、傳質效率低，常常導致啟動慢、效率低、周期長等問題，其中，揮發(fā)性脂肪酸（Volatile fatty acid，VFA）的積累引起的對產甲烷菌的抑制是主要原因之一。如何解除酸抑制是國內外研究的重點，目前已開發(fā)出了添加外源物質（如堿性試劑、微量元素等）、生物強化（添加或富集某種特定的菌）和消化液循環(huán)等多種技術。如WEI等的研究結果表明，加入微量元素可以緩解酸抑制作用，產甲烷量從0.13 L·g增加至0.44 L·g。ZHANG等的研究表明，添加NaOH調節(jié)初始pH至7.5，足以抵消厭氧消化系統(tǒng)pH值的下降，確保微生物的最適生長范圍，從而有效緩解酸抑制效應。李丹妮等研究了蛭石、海泡石和生物炭對混合厭氧發(fā)酵過程中酸抑制的緩解效應，結果顯示添加劑比例達到20%時可獲得最大累積甲烷產量，并且生物炭的效果最優(yōu)。LU等在接種物中添加乙酸溶液以富集耐酸性產甲烷菌，試驗結果表明，在適應酸40 d后，接種抗酸接種物使得啟動階段產甲烷量顯著提升。XUE等在玉米秸稈的厭氧消化中將50%的消化液再循環(huán)，該反應器產沼氣量比對照組高33.3%，平均沼氣產量和甲烷產量分別比對照組高58.4%和61.5%。同時，已有大量文獻報道微生物群落在厭氧共消化過程中的作用，如WANG等在對比玉米秸稈和豬糞共消化與單獨消化微生物群落動態(tài)變化的實驗中，采用16SrRNA測序技術，闡明共消化系統(tǒng)獲得高甲烷產量的內在原因。本課題組前期研究結果表明，分層接種能促進系統(tǒng)內乙酸和丁酸的分解轉化，即使在較低接種比下，仍能縮短厭氧干發(fā)酵遲滯期，提高甲烷產率，體系中較好的產甲烷性能是由于氫營養(yǎng)型產甲烷途徑占主導地位。上述研究為緩解酸抑制、提高厭氧干發(fā)酵產氣性能提供了有益借鑒。由于對酸抑制發(fā)生過程及與酸抑制密切相關的細菌、古菌的結構及功能缺乏深入研究，導致酸抑制解除技術措施缺乏足夠的理論依據，效果尚有待進一步提升。

本研究以豬糞為主要原料，開展批式厭氧干發(fā)酵實驗，對比酸抑制下豬糞秸稈混合發(fā)酵、豬糞單獨發(fā)酵產氣性能。采用MiSeq高通量測序技術并結合生物信息學，分析酸抑制下細菌和產甲烷古菌群落多樣性，闡明群落結構組成和變化特征，明晰引起細菌和產甲烷古菌群落變化的主控環(huán)境因子，揭示酸抑制對厭氧干發(fā)酵體系中微觀結構的影響，以期為揭示厭氧干發(fā)酵酸抑制機理、開發(fā)酸抑制防控技術提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗裝置與樣品采集

本實驗裝置和所取樣品與文獻[14]一致。實驗裝置為有機玻璃材質的自制立式厭氧反應器，其有效高度為750 mm，有效內徑為20 mm。裝置側面于垂直方向上設多個直徑為15 mm的取樣口，并用橡膠塞密封。裝置頂部設有閥門控制的排氣口并接鋁制集氣袋。豬糞和玉米秸稈均取自天津市西青區(qū)某規(guī)?；B(yǎng)殖場，新鮮豬糞當日采集后置于冰箱冷藏[（4±1）℃]存放，玉米秸稈自然風干后粉碎至1 mm，置于通風處干燥；接種物取自實驗室上一批次實驗剩余物。相關理化性質見表1。

表1 底物和接種物的理化指標Table 1 Characteristics of substrates and inoculum

1.2 實驗設計

本實驗以豬糞為主要原料，以酸抑制下的厭氧干發(fā)酵系統(tǒng)為研究對象。設置豬糞單獨發(fā)酵（P）、豬糞秸稈混合發(fā)酵（M）兩組發(fā)酵系統(tǒng)。每組發(fā)酵原料的總進料量均為10.22 kg，總固體（TS）為20.3%，接種比為25%（以VS計），其中M發(fā)酵組中糞稈比為1∶1（以VS計）。每組發(fā)酵方式設3組平行。裝料后檢測氣密性，向各反應器中通入氮氣以創(chuàng)造厭氧環(huán)境，室溫[（25~35）℃]下進行發(fā)酵。

1.3 理化參數(shù)測定

采用集氣袋法收集氣體，每1~2 d測定沼氣產量和甲烷百分含量；每2~3 d從反應器側面取樣冷藏以供理化指標測定；并根據產氣情況及理化指標變化，在發(fā)酵過程中的0 d（初始階段）、13 d（Ⅰ階段）、33 d（Ⅱ階段）、45 d（Ⅲ階段）和78 d（Ⅳ階段）從反應器側面取發(fā)酵樣品冷凍保存以供微生物分析。TS和VS含量、沼氣產量、沼氣組分和發(fā)酵體系VFA質量分數(shù)分析測量方法見文獻[14]，將取回的固體樣品稀釋10倍，振蕩混勻后用pH計測定pH值。

1.4 DNA提取與PCR擴增

采用E.Z.N.AMag-Bind Soil DNA Kit（OMEGA bio-tek,USA）試劑盒提取樣品DNA，利用瓊脂糖凝膠檢測DNA完整性，并用Nanodrop 2000分光光度計（Thermo Fisher Scientific，美國）測定DNA含量。

針對細菌和古菌16Sr RNA基因的V3~V4高變區(qū)序列，分別進行PCR擴增。利用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量，以確定PCR反應加入的DNA量。細菌第一輪擴增引物為341F（CCCTA?CACGACGCTCTTCCGATCTG（barcode）CCTAC?GGGNGGCWGCAG）和805R（GACTGGAGTTCCTTG?GCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC），第二輪擴增引入Illumina橋式PCR兼容引物。古菌引用槽式PCR擴增三輪，第一輪使用擴增引物M-340F（CCCTAYGGGGYGCASCAG）和GU1ST-1000R（GGCCATGCACYWCYTCTC）；第二輪使用第一輪PCR產物進行擴增，擴增引物為349F（CCCTA?CACGACGCTCTTCCGATCTN（barcode）GYGCASCAG?KCGMGAAW）和806R（GACTGGAGTTCCTTG?GCACCCGAGAATTCCAGGACTACVSGGGTATCT?AAT）；第三輪擴增中引入Illumina橋式PCR兼容引物。對于細菌和古菌擴增的PCR產物和正常擴增片段在400 bp以上的PCR產物，選用0.6倍的磁珠（Agencourt AMPure XP）進行DNA純化回收。利用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量，按照1∶1的等量混合后測序，測序平臺為MiSeq 2×300。

1.5 數(shù)據分析

使用Excel 2020和Origin 8.5進行理化指標統(tǒng)計并繪制圖表。在QIIME中調用Uclust（1.1.579）軟件，設置97%相似性，對有效DNA序列數(shù)據進行OTU分類，并對測序序列隨機抽樣，將抽到的序列數(shù)與其代表的OTU數(shù)目構建稀釋曲線。采用Mothur軟件進行Alpha多樣性分析，計算Chao、ACE、Shannon、Simpson和Coverage指數(shù)。利用RDP軟件比對Silva數(shù)據庫進行物種分類，在門和屬水平上統(tǒng)計樣本中物種的相對豐度。選取屬水平OTU豐度前50的代表性序列與數(shù)據庫中與其種屬信息一致的序列，使用MUSCLE進行多序列比對后，采用FastTree根據最大似然法（Approximately-maximum-likelihood phylogenetic trees）構建系統(tǒng)進化樹，推測未被分類菌屬在發(fā)酵體系中的作用。利用Canoco 5.0軟件進行冗余分析（Redundancy analysis，RDA），評價發(fā)酵系統(tǒng)中環(huán)境因子對主要微生物群落結構的影響。

2 結果與討論

2.1 酸抑制下厭氧干發(fā)酵的產氣性能

圖1為日甲烷產量（以VS計，下同）和沼氣中甲烷含量隨發(fā)酵時間的變化圖。P組的產甲烷性能在70 d前要優(yōu)于M組。由圖可知，P組的啟動時間長，前28 d日甲烷產量低于0.59 mL·g，之后明顯升高，47 d時達到3.32 mL·g，但峰值出現(xiàn)時間短，峰谷差較大，產氣性能不穩(wěn)定。與P組相比，10~70 d內M組的日甲烷產量相近，但在28~70 d內明顯低于P組。與日甲烷產量相對應，P組的甲烷含量在28~48 d內逐漸升高至66.80%，M組甲烷含量56 d前低于30%，之后明顯上升，70 d時高于50%。這表明P組和M組發(fā)酵產氣受到明顯抑制，M組抑制作用更強。KAIN?THOLA等的研究結果表明，厭氧共消化可以減小甲烷產生速率的峰谷差，從而確保穩(wěn)定的甲烷產量。但本實驗中M組產甲烷性能明顯較P組差，日甲烷產量一直處于低水平狀態(tài)，這可能是由于M組體系中酸化作用顯著，產氣效率受到影響。56 d后M組甲烷含量明顯升高，表明共消化體系中的產甲烷作用得到恢復，與JIANG等研究結果相似。

圖1 P組和M組產甲烷性能比較Figure 1 Comparison of methane production performance between Pand Msystems

2.2 厭氧干發(fā)酵酸抑制過程中pH與VFA的變化

兩組發(fā)酵體系過程中pH變化如圖2所示。反應初期，有機物被水解型細菌水解為VFA，而產甲烷古菌對有機固廢有一定的適應期，推測此時水解型細菌生長速率大于產甲烷古菌，出現(xiàn)酸積累，pH值相應降低。隨著發(fā)酵過程的進行，產甲烷古菌能及時將體系內VFA轉變?yōu)榧淄?，P組的pH值于30 d后開始升高，結合圖1，此時P組產甲烷速率和甲烷產量均呈上升趨勢。而M組的pH值總體上無明顯升高趨勢，并且體系中產氣性能較差。雖然稀釋固態(tài)樣品測得的pH值會有一定偏差，但總體變化趨勢仍能反映體系中總揮發(fā)性有機酸（TVFAs）的大致情況，以便后續(xù)對體系中VFA的變化進行深入分析。

圖2 厭氧干發(fā)酵過程中pH變化Figure 2 Variations of pH during the experiment

兩組發(fā)酵體系過程中VFA質量分數(shù)變化如圖3所示。第8 d起，M組VFA質量分數(shù)開始高于P組，之后兩組間的VFA質量分數(shù)差呈現(xiàn)遞增趨勢，并至61 d質量分數(shù)差最大，達17.23 mg·g。8~78 d M組與P組的VFA質量分數(shù)差主要來源于丁酸，丁酸質量分數(shù)差介于2.14~11.97 mg·g。DEMIREL等得出結論，當丙酸質量濃度超過951 mg·L時會抑制產甲烷菌的生長，而此時加入丁酸可在一定程度上改善其抑制作用。WANG等的研究中，丁酸質量濃度最高至1 800 mg·L時對產甲烷菌的活性沒有明顯抑制。本實驗中P組丁酸質量分數(shù)自第45 d起開始下降，并至54 d消耗完全；M組丁酸質量分數(shù)自第15 d起直至發(fā)酵結束一直保持在9.49~12.68 mg·g，結合圖1可知，本實驗中丁酸可能不是引起酸抑制效應的原因。

圖3 厭氧干發(fā)酵過程中VFA質量分數(shù)變化Figure 3 Variations of concentration of VFA during the experiment

由于高質量濃度的丙酸積累意味著消化失衡，在P組消化過程的后期（48 d后），丙酸作為體系中VFA的主要組成成分，會破壞厭氧消化的性能，使得產氣性能大幅度下降。前期研究表明，厭氧發(fā)酵體系中最適的丙酸質量濃度范圍在800~3 000 mg·L，超過此范圍不利于產甲烷菌降解利用。本實驗中，P組的丙酸質量分數(shù)在10~78 d超出抑制質量濃度（3 000 mg·L），且P組丙酸質量分數(shù)在第61 d時迅速增加至9.89 mg·g，發(fā)酵結束時到達峰值10.58 mg·g。而在45 d后，P組乙酸質量分數(shù)從5.01 mg·g驟降至0.58 mg·g，結合圖1，說明本實驗中P組酸抑制的主體可能是高質量分數(shù)的丙酸。M組的丙酸質量分數(shù)雖然在8~78 d超出抑制質量濃度，但在15 d至發(fā)酵結束時丙酸質量分數(shù)在5.18~7.33 mg·g范圍內波動，而乙酸質量分數(shù)卻在第48 d時下降了28.88%，結合圖1，說明本實驗中M組酸抑制的主體可能是高質量分數(shù)的乙酸。M組前期酸化嚴重，阻礙了產甲烷菌的生長，而水解產酸菌對pH的耐受范圍更廣，對VFA耐受能力更強，因此M組前期水解過程未受到明顯抑制，從而加重了混合發(fā)酵體系中的酸抑制效應。有研究報道，相比于單獨消化，共消化具有多種優(yōu)勢，可以改善C/N并豐富微生物群落，但本研究中M組酸抑制效應更強?？赡苁窍到y(tǒng)有機負荷過高，水解產酸菌會產生大量VFA，而產甲烷古菌代謝速率較為緩慢，無法在短時間內快速利用產生的VFA，從而造成酸抑制現(xiàn)象，因此仍需從微生物角度分析本實驗產生酸抑制效應的原因。結合前期的研究，分層接種的發(fā)酵方式可以促進體系內乙酸和丁酸的分解轉化，縮短發(fā)酵遲滯期，進一步證實本實驗中M組發(fā)酵啟動困難與體系中VFA的積累有關。

2.3 古菌和細菌多樣性分析

在OTU為97%的相似性水平下，對2組發(fā)酵體系中古菌群落的多樣性進行分析。由表2可見，所有樣本均有99%的覆蓋率，Shannon指數(shù)稀釋曲線（圖4a）隨著序列數(shù)的增加迅速趨于平緩，表明每個樣品中的主要微生物種群均具有可靠的測序深度。Chao指數(shù)和ACE指數(shù)與微生物群落的豐富度呈正相關，第Ⅰ階段兩組發(fā)酵體系的菌群豐富度都有一定的下降，可能是由于體系中VFA質量分數(shù)突然增加使得物種仍處在適應期。隨著發(fā)酵時間的延長，P組的物種豐富度基本呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，而M組末期（第Ⅳ階段）群落豐富度顯著下降。Shannon指數(shù)與Simpson指數(shù)體現(xiàn)了局域均勻環(huán)境下的微生物群落的多樣性，Shannon指數(shù)與多樣性呈正相關，Simpson指數(shù)與之相反；前者強調豐富性，后者側重于均勻性?？傮w上，M組的物種多樣性不如P組，且發(fā)酵中后期（Ⅲ~Ⅳ階段）OTU分布的均勻度顯著降低。上述結果表明，混合發(fā)酵體系中古菌群落結構發(fā)生顯著變化，物種多樣性和分布均勻度都明顯下降。表明VFA積累抑制了產甲烷過程，使古菌多樣性下降。

表2 古菌群落多樣性指數(shù)Table 2 Richnessand diversity of archaeal communities

圖4 古菌和細菌的Shannon指數(shù)稀釋曲線圖Figure 4 Shannon rarefraction plot of archaeal and bacterial communities

P組與M組發(fā)酵體系中古菌群落在門、屬水平上的分布結果如圖5所示。在門水平上主要有2種優(yōu)勢菌門，其中廣古菌門（Euryarchaeota）占絕對優(yōu)勢，相對豐度在95.41%~99.66%，泉古菌門（Crenarchaeota）約占0.23%~4.08%。目前已知的產甲烷古菌主要屬于Euryarchaeota，能將厭氧消化過程中分解大分子有機物產生的乙酸、H、CO和甲基類小分子物質轉變成甲烷。在屬水平上，專性乙酸營養(yǎng)型的甲烷絲菌屬（）與氫營養(yǎng)型的甲烷微菌屬（）、甲烷球形菌屬（）以及甲烷短桿菌屬（）是2個體系中的優(yōu)勢菌屬。其中，在PⅠ中升高至45.48%后保持相對穩(wěn)定，而在M組中從M0的43.04%降低至MⅠ、MⅡ中的28.23%和21.49%。HINSBY等的研究表明，當相對豐度增加時，能夠促進厭氧干發(fā)酵產甲烷過程，結合圖1，M組中期甲烷含量較低，且該菌的相對豐度與日甲烷產量呈正相關，這與前期的研究結果一致。相對豐度在2個發(fā)酵組中隨著時間的延長呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，結合圖2可知，階段Ⅰ~Ⅱ中VFA質量分數(shù)處于較高水平（P組：22.35~26.34 mg·g；M組：24.58~32.17 mg·g），此時對應的該菌相對豐度較大（P組：21.96%~22.97%；M組：37.06%~38.32%），可見相對豐度與VFA質量分數(shù)呈正相關。只能專性利用H/甲醇產甲烷，無法利用乙酸和H/CO等物質，因此隨著發(fā)酵過程中VFA的積累，2個體系中該菌的相對豐度均呈現(xiàn)降低趨勢。對酸性不敏感且代謝類型多樣，因此在2個體系的發(fā)酵后期均逐漸富集，其在厭氧發(fā)酵過程中相對豐度的變化沒有特定的規(guī)律可循，仍需進一步的研究。此外，隨著消化過程的進行，M組群落中氫營養(yǎng)型產甲烷菌（、、、和）總體相對豐度范圍在57.09%~77.19%，這表明M組發(fā)酵體系中以氫營養(yǎng)型產甲烷途徑為主。有研究表明，氫營養(yǎng)型產甲烷菌比乙酸營養(yǎng)型產甲烷菌有更高的活性，且在高VFA環(huán)境壓力下大多數(shù)產甲烷菌會經歷氫營養(yǎng)型產甲烷途徑，推測在酸抑制環(huán)境下氫營養(yǎng)型產甲烷菌的占比與厭氧干發(fā)酵系統(tǒng)的產氣性能密不可分。

圖5 古菌在門水平和屬水平上群落結構多樣性分析Figure 5 Analysis of archaeal diversities at the phylumand genus level

同古菌分析方法一致，細菌群落多樣性指數(shù)見表3，Shannon指數(shù)稀釋曲線（圖4b）表明測序深度可靠。隨著發(fā)酵時間的延長，M組中細菌豐富度逐漸增加并高于P組，可見混合原料發(fā)酵可以改善發(fā)酵系統(tǒng)中C/N，平衡營養(yǎng)，給予微生物充足的微量元素?？傮w上來說，較低的Simpson指數(shù)表明單獨發(fā)酵的OTU分布更均勻。在厭氧發(fā)酵體系中，微生物群落多樣性越高，產氣性能越好。M0~Ⅱ階段Shannon指數(shù)均分別低于P0~Ⅱ，可見M組前期的水解酸化階段加重了體系內酸抑制效應。對比表2和表3，無論是單獨發(fā)酵還是混合發(fā)酵體系，細菌群落多樣性和豐富度均明顯高于古菌。

表3 細菌群落多樣性指數(shù)Table 3 Richness and diversity of bacterial communities

P組與M組發(fā)酵體系中細菌群落在門、屬水平上的分布結果如圖6所示。厚壁菌門（Firmicutes）是主要的優(yōu)勢菌門，相對豐度均在73%以上，最高達92%。其次是擬桿菌門（Bacteroidetes），占0.99%~16.51%，變形菌門（Proteobacteria）最高也有6.76%的占比。Firmicutes門多為水解型細菌，主要功能是將纖維素、木質素以及脂肪和蛋白質水解成為小分子酸；Bacteroidetes則可以將蛋白質等水解酸化為小分子有機酸。Firmicutes在M0~Ⅱ的相對豐度逐漸增加，說明玉米秸稈、糞便被較好地分解利用，秸稈的加入增加了接種物中潛在的電子供體含量，極大地刺激了微生物活性。此外，有研究報道Firmicutes能夠形成內生孢子以抵御不良環(huán)境，因此即使在酸化嚴重的環(huán)境下該菌門的相對豐度依然很高。兩個體系中，發(fā)酵末期（第Ⅳ階段）Firmicutes相對豐度最低，而Bacteroidetes明顯升高，這可能與大分子底物被分解消耗、小分子有機酸逐漸積累有關。Proteobacteria和綠彎菌門（Chloroflexi）常見于厭氧發(fā)酵體系，能夠水解一定的有機大分子化合物，2菌門相對豐度在M組的發(fā)酵前期（Ⅰ~Ⅱ階段）均呈現(xiàn)下降趨勢（前者較初始階段減少約588%，后者減少約113%），而在第Ⅲ階段有一定程度回升（前者較第Ⅱ階段增加2.50倍，后者增加4.20倍）。螺旋體門（Spirochaetes）能夠水解利用半纖維素，M組末期（第Ⅳ階段）該菌門相對豐度較前期（第Ⅰ階段）增加約18.78倍?；ヰB(yǎng)菌門（Syn?ergistetes）在厭氧發(fā)酵中也起到促進有機物的水解和酸化作用。有研究表明，在產酸階段Synergistetes門的許多菌屬可以與產甲烷菌共培養(yǎng)，將含4~8個C的直鏈脂肪酸降解為丙酸酯、乙酸鹽和甲烷，同時可以通過與產甲烷菌的協(xié)同作用，將蛋白質降解成所需底物。而本研究中M組前期（Ⅰ~Ⅱ階段）Syner?gistetes的相對豐度與M0時基本一致，僅占0.13%左右，而PⅡ階段該菌相對豐度比P0時增加約1.56倍。在AKYOL等的研究中，對照厭氧消化池中前20 d VFA質量分數(shù)比經真菌預處理組高，此時對照組中Synergistetes相對豐度僅占0.1%，而在預處理組中占6.4%~7.5%。因此推測高VFA環(huán)境不利于Syner?gistetes生長代謝，阻礙了與產甲烷菌的協(xié)同作用，造成產氣困難。

圖6 細菌在門水平和屬水平上群落結構多樣性分析Figure 6 Analysis of bacterial diversities at the phylumand genuslevel

在2個發(fā)酵體系中，狹義梭菌屬是絕對優(yōu)勢菌屬，占32.74%~51.98%。該屬不僅能夠水解多糖促進產酸，還可以分泌降解復雜碳水化合物所需的酶。在2個體系中隨著發(fā)酵時間的延長，的相對豐度均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。這是因為隨著時間延長，該屬生長代謝所利用的多糖被大量消耗，導致PⅢ階段菌群減少，水解速率降低，而乙酸又被產甲烷古菌大量利用，結合圖3，可以解釋48 d乙酸質量分數(shù)顯著降低。由于M組底物中添加了玉米秸稈，增加了纖維素含量，所以M組各時期該菌的相對豐度均高于P組?？梢岳冒l(fā)酵體系中的葡萄糖產生氫，主要的代謝產物包括乙酸鹽、甲酸鹽和乳酸鹽。在M組中，隨著纖維素等多糖類被水解為葡萄糖，使得該菌在第Ⅳ階段相對豐度最高，達12.68%。隨著P組發(fā)酵后期丙酸質量分數(shù)的升高，相對豐度明顯降低；同樣，M組中也能觀察到類似的現(xiàn)象，推測高質量分數(shù)丙酸對的生長代謝起抑制作用。因其參與初期的蛋白質水解代謝，在2個體系中發(fā)酵初期豐富度最高，占11.34%~13.69%，而PⅠ階段下該菌相對豐度為6.68%，是MⅠ階段下的1.87倍，可見高VFA環(huán)境會加速其失活。值得注意的是，unclassified菌屬相對豐度最高可達12.11%（PⅢ樣本中），因此仍需通過系統(tǒng)進化進一步分析其在發(fā)酵過程中的作用。

2.4 微生物系統(tǒng)進化分析

圖7為前50個OTU代表性序列與數(shù)據庫序列系統(tǒng)發(fā)生進化樹環(huán)狀圖。根據分支情況和樹枝長短情況來看，圖a中，OTU為4、12、13的unclassified菌屬與亞硝化球菌屬（）親緣關系較近，對發(fā)酵體系的產甲烷性能沒有明顯的貢獻。圖b中，OTU45的unclassified菌屬與可利用糖類產酸的、可分泌脲酶降解尿素的以及可參與初期蛋白質水解代謝的等菌同屬一個分支，可見細菌屬中檢測出的這些未被分類的菌可能具有分解底物中有機物、加速水解酸化的作用。值得注意的是，被證實在厭氧消化中積極參與產酸過程，并轉移電子給產甲烷古菌，可以增加甲烷產量；OTU38的unclassified菌屬與同屬一個分支，表明它可能具有增加甲烷產量的作用。

圖7 古菌與細菌的系統(tǒng)發(fā)生進化樹環(huán)狀圖Figure 7 Ring diagramof phylogenetic tree of archaea and bacteria

2.5 冗余分析

采用冗余分析對P組和M組的微觀群落結構和宏觀環(huán)境因子進行相關性研究，選取pH、SCOD、總酸、丙酸和乙酸5個理化指標（總酸、丙酸和乙酸均為質量分數(shù)，其中總酸指TVFA）。剔除不顯著因素后，RDA模型結果見圖8。對于P組，軸1和軸2分別解釋了66.45%和25.97%的變異性，總體上微生物群落演變解釋度為丙酸>SCOD>pH>總酸，因此影響P組微觀生態(tài)的主要環(huán)境因子為丙酸。從樣方分布來看，穩(wěn)定產氣階段分布在二、三象限，且發(fā)酵第45 d與第78 d群落結構相似度較高。環(huán)境因子間的相關性表明，丙酸與pH的相關度較高，這與P組后期丙酸積累過多有關。物種與環(huán)境因子的相關性表明，和與TVFA和乙酸均呈極顯著正相關，說明它們的存在促進體系中乙酸的增加，是分解纖維素產酸的主要貢獻者。與丙酸呈極顯著負相關，說明P組環(huán)境中逐漸積累的丙酸會抑制該菌的生長，進而影響體系的產氣性能。丙酸的積累同樣對和產生負面作用。對于M組，軸1和軸2分別解釋了77.81%和18.86%的變異性。環(huán)境因子對M組微生物群落演變的解釋度為pH>SCOD>總酸>乙酸，并且隨著發(fā)酵的進行，樣品從橫軸的正端向負端移動，pH為該體系微生物結構變化的主要驅動因子，其解釋度為45.3%。在軸2方向上，總酸、SCOD和乙酸對微生物群落結構的影響均較大，證明M組酸抑制作用明顯，且體系中酸抑制主體為乙酸。對比P組，M組中和與乙酸呈負相關，說明酸抑制環(huán)境下乙酸質量分數(shù)的升高會對氫營養(yǎng)型產甲烷途徑產生抑制作用。在軸1方向上，pH更多地解釋了厭氧發(fā)酵過程中主要微生物菌群的變化。隨著發(fā)酵時間的延長，M組中古菌主要優(yōu)勢菌屬發(fā)生了演替，由轉變?yōu)楹汀ｓw系中的產甲烷途徑從以乙酸營養(yǎng)型為主轉變?yōu)闅錉I養(yǎng)型與乙酸營養(yǎng)型相結合的方式。結合圖8a與圖8b可知，厭氧干發(fā)酵過程中酸抑制的主體總是與體系中初始階段的優(yōu)勢菌群呈負相關，因此酸抑制的發(fā)生對菌群結構的演替有很大影響。

圖8 單獨發(fā)酵與混合發(fā)酵系統(tǒng)的冗余分析Figure 8 Redundancy analysis of mono-fermentation and co-fermentation systems

3 結論

（1）混合發(fā)酵體系中酸抑制效應嚴重，M組（豬糞秸稈混合發(fā)酵）前期產氣性能明顯較差，甲烷含量在56 d后呈明顯上升趨勢，表明體系中產甲烷菌可能在高VFA質量分數(shù)下逐漸恢復活力。

（2）可以促進厭氧干發(fā)酵體系產生甲烷，其相對豐度與日甲烷產量呈正相關；而相對豐度與VFA質量分數(shù)呈正相關。M組發(fā)酵體系中以氫營養(yǎng)型產甲烷途徑為主。

（3）古菌中OTU為4、12、13的unclassified菌屬，對發(fā)酵體系的產甲烷性能沒有明顯的貢獻。而細菌中未被分類的OTU45和OTU38菌屬應引起重視。

（4）影響2組發(fā)酵體系的主要酸抑制種類不同，逐漸積累的丙酸會影響P組（豬糞單獨發(fā)酵）的產氣性能，M組中酸抑制的主體為乙酸。酸抑制的發(fā)生對菌群結構的演替有很大影響，可見如何避免酸抑制是提高厭氧干發(fā)酵產氣性能的關鍵。