杜瑋，周建龍，葉丹

（1.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院 內(nèi)六科，廣東 廣州 510010；2.廣州市番禺區(qū)何賢紀念醫(yī)院，廣東 廣州 511400）

長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長度＜200 nt的RNA分子，其不編碼任何的蛋白質(zhì)，而是以RNA的形式存在。lncRNA早期普遍被認為是基因組轉(zhuǎn)錄的噪音，不具有任何生物學功能[1-3]。隨著近年研究的深入，一些lncRNA的功能被逐漸闡明，發(fā)現(xiàn)lncRNA在表觀遺傳水平的調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，對腫瘤的發(fā)生發(fā)展及胚胎干細胞上面都發(fā)揮重要作用[1-3]。已有數(shù)據(jù)表明SBF2-AS1作為1個新的lncRNA在肺癌組織中高表達[4]，因此本研究選其為實驗對象，驗證其在肺癌組織中的表達情況，并研究其與肺癌病例特征的關(guān)系，并進一步研究探討其對肺癌細胞生物學功能的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2011～2015年廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院肺癌組織樣本，納入標準：①經(jīng)病理確診的肺癌患者；②患者術(shù)前均未行放、化療。手術(shù)切除癌組織及癌旁組織立即放入液氮，而后置入-80℃冰箱冷凍保存。所有標本均經(jīng)病理檢查確診?；颊吆炇鹬橥鈺@醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.2 主要試劑

RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）試劑盒（大連寶生物工程有限公司），MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），PE-Annexin-V/7-AAD細胞凋亡試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），Lipofectamine RNAimax reagent（美國 Invitrogen 公司）。

1.3 方法

1.3.1 總RNA的提取及qRT-PCR檢測 采用Trizol法提取肺癌及癌旁組織總RNA，分光光度計法測定提取RNA的濃度及純度。按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書2步法完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA。qRT-PCR檢測癌組織及癌旁組織SBF2-AS1的表達量。SBF2-AS1的qRT-PCR引物序列為5'-AGACCATGTGGACCTGTCACTG-3'（ 正 向 引物）5'-GTTTGGAGTGGTAGAAATCTGTC-3'（反向引物）；內(nèi)參GAPDH（磷酸甘油醛脫氫酶）的引物序列為5'-CCACATCGCTCAGACACCAT-3'（正向引物）5'-ACCAGGCGCCCAATACG-3'（反向引物）。

1.3.2 細胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 培養(yǎng)A549細胞，在轉(zhuǎn)染前1天鋪6孔板，使細胞密度在70%左右，鋪好細胞后的第2天按照Lipofectamine RNAimax reagent的說明書轉(zhuǎn)染細胞。siRNA 序列為分別為si204：5'-CAG AAGGAGUCUACUGCUAAG-3'；si1021：5'-GCAAGCC UGCAUGGUACAUTT-3'。

1.3.3 細胞增殖速率檢測 在轉(zhuǎn)染24 h后用96孔板鋪細胞，每個孔鋪2 000個細胞，3個復孔。然后37℃，5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。按照MTT說明書分別檢測24、48、72和96 h時的450 nm波長吸光度。做出細胞的增值曲線。

1.3.4 流式細胞儀檢測細胞的凋亡和周期 用不含EDTA的胰酶消化轉(zhuǎn)染后的細胞，檢測細胞凋亡時按照PE-Annexin-V/7-AAD細胞凋亡試劑盒說明書雙染細胞，流式檢測，分析早期凋亡及晚期凋亡細胞比例。檢測細胞周期時，細胞離心，去上清，用預冷的PBS洗2遍，然后用75%的乙醇重懸，-20℃固定過夜，離心，PBS洗滌后加10 mg/L溴化丙啶和0.1%的RNase A的PBS溶液300μl，室溫避光染色10 min后，流式細胞儀檢測細胞周期，分析細胞G1/G0、S期及G2期細胞比例變化。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩樣本均數(shù)的比較采用配對t檢驗或獨立樣本t檢驗，兩組以上樣本均數(shù)的比較采用析因設(shè)計的方差分析，分類資料采用χ2檢驗或Fisher精確概率法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 SBF2-AS1在非小細胞肺癌中的表達及與臨床病例特征的關(guān)系

已有關(guān)于非小細胞肺癌中長鏈非編碼RNA表達譜的數(shù)據(jù)表明，SBF2-AS1在肺癌中高表達。本研究在48例肺癌患者組織樣本中檢測SBF2-AS1的表達量，結(jié)果表明與正常組織比較，肺癌組織SBF2-AS1表達量升高。其相對表達量為正常組織的5.05倍（P＜0.05）。并且SBF2-AS1的表達量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床病理分期有密切關(guān)系。見附表。

2.2 SBF2-AS1在293T、H1299及A549細胞中的表達

SBF2-AS1在非小細胞肺癌細胞系A(chǔ)549、H1299的表達量與293T相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），結(jié)果見圖1所示。選定A549和H1299細胞作為研究對象，進行后續(xù)實驗。

2.3 SBF2-AS1對A549細胞增殖的影響

兩條siRNA（si204，si1021）都能干擾SBF2-AS1的表達，導致SBF2-AS1的表達量降低，見圖2所示，但si1021的效果優(yōu)于si204，因此選擇si1021進行后續(xù)試驗。MTT細胞增殖實驗結(jié)果表明，SBF2-AS1的表達被干擾降低后導致A549和H1299細胞的增殖速率減慢，見圖3?？瞻讓φ战M（blank組）與siRNANC組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），si1021組與siRNA-NC組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

附表 SBF2-AS1在肺癌組織樣本中的表達及與臨床病例特征的關(guān)系 例

圖1 SBF2-AS1在293T、H1299及A549細胞中的表達

圖2 si204和si1021干擾SBF2-AS1的表達

圖3 SBF2-AS1對A549和H1299細胞增殖的影響

2.4 SBF2-AS1對A549和H1299細胞凋亡的影響

siRNA-NC組與blank組比較差異無統(tǒng)計學意義，si1021組細胞凋亡率與siRNA-NC組細胞凋亡率比較，A549為（11.31±1.792）% vs （3.35±2.014）%（P＜0.05）；H1299 為（17.89±1.792）% vs（9.16±2.014）%（P＜0.05）。結(jié)果表明si1021干擾SBF2-AS1表達量下降后，A549及H1299細胞凋亡增加，所以SBF2-AS1促進腫瘤生存。見圖4。

2.5 SBF2-AS1對A549和H1299細胞周期的影響

2種細胞各個時期細胞比例siRNA-NC組與blank組比較差異無統(tǒng)計學意義。對于A549細胞來說，與siRNA-NC組比較，si1021組G1/G0細胞由65.66%增至72.84%，而S期+G2期細胞由（34.34±2.32）%降至（27.16±1.59）%（P＜0.05），對 H1299細胞來說，與NC組比較，si1021組G1/G0細胞由67.84%加至84.67%，而S期+G2期細胞由（32.16±2.32）%降至（15.33±1.59）%（P＜0.05）。見圖 5。

圖4 SBF2-AS1對A549及H1299細胞凋亡的影響

圖5 SBF2-AS1對A549和H1299細胞周期的影響

3 討論

近年來，隨著lncRNA的深入研究，大量研究結(jié)果表明lncRNA與實體瘤如腦[5-6]、肺[7-8]、乳腺[9]、胰腺[10-11]、肝[12]等有密切關(guān)系。這為癌癥的研究提供了更為廣闊的思路。對于肺癌來說，眾多特異性的lncRNA也逐漸被發(fā)現(xiàn)。

SBF2-AS1作為一個新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，并未有相關(guān)功能研究的報導。首先根據(jù)僅有的數(shù)據(jù)提示，檢測其在肺癌及癌旁組織表達量的差異，發(fā)現(xiàn)其在癌組織中高表達。并由此進一步分析其表達量與臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其與肺癌臨床病理分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。在非小細胞肺癌細胞株A549和H1299用siRNA干擾SBF2-AS1的表達，使其表達水平下降之后，分析SBF2-AS1對肺癌細胞株功能的影響。發(fā)現(xiàn)隨著SBF2-AS1的表達下調(diào)，A549和H1299細胞增殖均減慢，流式細胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡比例增加，細胞周期出現(xiàn)G1/G0阻滯。已有諸多相關(guān)研究表明，lncRNA可通過調(diào)節(jié)細胞增殖與凋亡之間的平衡來調(diào)控細胞生長，這也是lncRNA發(fā)揮功能的1個機制，如 lncRNA GAS5[13]、PCGEM1[14]、PCAT-1[15]、CCAT2 等[16]功能的相關(guān)研究，SBF2-AS1亦可通過影響細胞周期調(diào)控細胞增殖。

綜上所述，SBF2-AS1在肺癌組織中高表達且其表達量與患者的臨床病理分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。該lncRNA的高表達還會通過對凋亡和細胞周期的調(diào)節(jié)加快肺癌細胞株的增殖速率。新的lncRNA SBF2-AS1功能的發(fā)現(xiàn)及闡明提供了新的肺癌診斷及預后判斷的分子標志物，及潛在的治療靶點。但其具體轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制還有待進一步闡明。

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