賀曉靜， 賀 潔

(1開封大學(xué)醫(yī)學(xué)部， 2河南大學(xué)生命科學(xué)院， 河南 開封 475000)

肝癌是世界上最流行的惡性腫瘤之一，全球每年新發(fā)病例達(dá)200萬例。5年生存率低至5%[1]。鑒于肝癌患者手術(shù)和化療后的預(yù)后不良，為了改善治療，因此，需要探索更多的治療方法。近些年，腫瘤免疫治療已經(jīng)成為一個很有發(fā)展前景的治療方法。這種方法具有消除全身腫瘤細(xì)胞的潛力，并具有區(qū)分腫瘤和非腫瘤細(xì)胞的特異性。在惡性腫瘤組織中過表達(dá)的基因或抗原是特異性腫瘤免疫治療的先決條件[2]。MAGEC2 (GenBank： AF151378)幾乎不出現(xiàn)在正常組織中，僅在睪丸中檢測到MAGEC2 的mRNA表達(dá)；但是在肝癌、惡性黑色素瘤和膀胱癌中具有高水平的MAGEC2表達(dá)。它又被稱為肝細(xì)胞癌相關(guān)抗原587(hepatocellular carcinoma-associated antigen 587，HCA587)。HCA587是從肝癌患者的肝癌組織DNA表達(dá)文庫中克隆出來、且在多種腫瘤組織中高表達(dá)的一種新型腫瘤/睪丸(cancer/testis，CT)抗原[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)，肝癌樣品中有特別高的MAGEC2表達(dá)，mRNA水平為70%，蛋白水平為38%[5]。腫瘤抗原多肽誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T-lymphocyte，CTL)除了具有特異性外，在設(shè)計上還可以對野生型多肽進(jìn)行改造，從而提高主要組織相容性(抗原)復(fù)合物(major histocompatibility complex，MHC)分子的結(jié)合力，以及T細(xì)胞識別的兼并性等。本研究使用NetCTL 1.2、SYFPEITHI和IEDB等生物信息學(xué)軟件進(jìn)行綜合預(yù)測，篩選出綜合打分較高的表位，并對優(yōu)勢表位進(jìn)行適當(dāng)替換，通過鑒定篩選出新的MAGEC2 HLA-A2限制性CTL表位[6-7]。多肽疫苗的設(shè)計核心是T細(xì)胞表位，其鑒定和改造是多肽疫苗發(fā)展及應(yīng)用的基礎(chǔ)[8-10]。

材 料 和 方 法

1 材料

T2細(xì)胞和HepG2細(xì)胞(MAGEC2+、HLA-A2+)[6]由開封大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗室常規(guī)保存，在37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)條件下常規(guī)培養(yǎng)。外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)由HLA-A2+健康供者捐贈。HLA-A2+外周血健康供者來自課題組尋找的健康供者。

2 方法

2.1HLA-A2限制性CTL表位肽的預(yù)測 使用NetCTL 1.2(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/)、SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)和IEDB(http://tools.iedb.org/main/tcell/)軟件對MAGEC2氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測打分。分別打開這3種預(yù)測軟件的主頁，進(jìn)入 CTL 表位預(yù)測界面。本次研究以A2超型為主；參數(shù)設(shè)定：CTL表位限制性MHC類型為HLA-A*0201；預(yù)測抗原肽為nonamers (9 aa)。根據(jù)各個預(yù)測軟件所推選的前10個優(yōu)勢表位進(jìn)行綜合選擇，選出在各種軟件打分較好的HLA-A2限制性表位[11]。

2.2HLA-A2限制性CTL表位肽的合成 候選表位肽由上海生工生物工程有限公司合成，經(jīng)HPLC分析純化后，其純度>95%，質(zhì)譜分析其相對分子質(zhì)量符合理論值。

2.3質(zhì)譜鑒定 采用電噴霧電離質(zhì)譜(electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS)鑒定多肽。我們使用的儀器是德國布魯克道爾頓儀器公司的BRU KER Esquire-3000電噴霧-離子阱多級質(zhì)譜儀。根據(jù)質(zhì)譜鑒定結(jié)果與肽段分子量進(jìn)行對比，確定所合成的多肽是否為設(shè)計的表位肽。電噴霧質(zhì)譜條件設(shè)置：噴霧器壓力為7.0或11.0 Psi；干燥器流速為4.0或8.0 L/min；溫度為300 ℃；噴霧針電壓為4.0 kV。G2025A Software A.02.01數(shù)據(jù)分析軟件檢測精肽的分子質(zhì)量。

2.4表位肽與HLA-A2分子結(jié)合力實驗 收集T2細(xì)胞，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基洗3次，調(diào)整細(xì)胞密度至1×109/L，鋪于24孔板中(每孔1 mL)，每實驗孔加入待測肽50 μmol/L，β2-微球蛋白3 mg/L，37 ℃、5% CO2共孵育18 h后，冷PBA洗滌3次，加入500 μL稀釋度為1∶100的單克隆抗體(鼠抗人β2-微球蛋白)，4 ℃避光靜置40 min。之后冷PBA洗滌3次，加入50 μL稀釋度為1∶50的FITC-羊抗鼠抗體溶液，4 ℃靜置40 min，PBA洗滌1次后上流式細(xì)胞儀檢測。其結(jié)果用熒光指數(shù)表示：熒光指數(shù)(flourescence index，F(xiàn)I)=(表位肽平均熒光強度-背景平均熒光強度)/背景平均熒光強度。FI>1.0表示高等結(jié)合力，1.0>FI>0.5表示中等結(jié)合力，F(xiàn)I<0.5表示低結(jié)合力。

2.5CTL的體外誘導(dǎo) 抽取HLA-A2+健康供者的外周血，肝素鈉抗凝，經(jīng)常規(guī)聚蔗糖-泛影葡胺分層液梯度離心，獲取PBMCs，用含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×109/L。第2天分別加入10 mg/L的候選肽共培養(yǎng)，第3天加入5×104U/L的rIL-2繼續(xù)培養(yǎng)。每周收集細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min，除去上清，加入新鮮的10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基，同時加入上述條件的候選肽和rIL-2。刺激3輪后于最后一次刺激的第3天收集細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞濃度作為效應(yīng)細(xì)胞。用無血清IMDM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度作為靶細(xì)胞。

2.6IFN-γ分泌水平的檢測 取出酶聯(lián)免疫斑點(enzyme-linked immunospot，ELISPOT)實驗板條(購自達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)，加200 μL無血清的IMDM培養(yǎng)基進(jìn)行封閉，靜置10 min；誘導(dǎo)的CTL作為效應(yīng)細(xì)胞，荷肽的T2作為刺激細(xì)胞，細(xì)胞濃度均調(diào)整為2×109/L；設(shè)立對照孔和實驗孔；37 ℃、5% CO2孵育18 h；傾盡孔中培養(yǎng)基，每孔加入200 μL無菌的去離子水，4 ℃ 裂解細(xì)胞10 min；傾盡孔內(nèi)液體，加入200 μL 1×Washing Buffer 洗滌6次，每次停留60 s；加入 100 μL生物素標(biāo)記的抗體，37 ℃ 孵育1 h；傾盡孔內(nèi)液體，加入200 μL 1×Washing Buffer進(jìn)行洗滌，方法同上，在吸水紙上拍干；加入100 μL酶聯(lián)親和素，37 ℃ 孵育1 h；每孔加入200 μL 1×Washing Buffer進(jìn)行洗滌，方法同上；加入100 μL現(xiàn)配的AEC顯色液，25 ℃避光靜置30 min；結(jié)束后置于通風(fēng)處，室溫靜置干燥；結(jié)果用 ELISPOT 圖像分析儀計數(shù) 96 孔板中每孔的斑點數(shù)[12]。

2.7細(xì)胞毒活性檢測 調(diào)整CTL細(xì)胞濃度為5×109/L；調(diào)整靶細(xì)胞HepG2細(xì)胞濃度為1×108/L；按50∶1、25∶1和12.5∶1的不同效靶比鋪于96孔板中，同時設(shè)立效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放組、靶細(xì)胞自發(fā)釋放組、靶細(xì)胞最大釋放組、體積校正組和背景對照組，每孔終體積為100 μL。37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)4 h。于孵育結(jié)束前45 min，在靶細(xì)胞最大釋放組及體積校正組中加入10 μL裂解液。1 000 r/min離心4 min，轉(zhuǎn)移50 μL上清至另一干凈96孔板中，每孔加入50 μL底物混合液，室溫避光孵育30 min；每孔再加入50 μL終止液。用酶標(biāo)儀檢測其在490 nm波長處的吸光度(A)值。殺傷率(%)=(實驗孔A值-效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放A值-CTL自發(fā)釋放A值)/(靶細(xì)胞A值-效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放A值)×100%。

2.8胞內(nèi)因子染色法 誘導(dǎo)的CTL作為效應(yīng)細(xì)胞，荷肽的T2細(xì)胞作為刺激細(xì)胞；陰性對照孔每孔加入1×109/L的效應(yīng)細(xì)胞；陽性對照孔每孔加入1×109/L的效應(yīng)細(xì)胞和100 μL植物血凝素再補加900 μL無血清的IMDM培養(yǎng)基培養(yǎng)。加入阻斷劑brefeldin A 5 mg/L到培養(yǎng)體系中，充分混勻。培養(yǎng)箱中37 ℃、5% CO2孵育4 h；孵育結(jié)束后，1 500 r/min，離心5 min，收集細(xì)胞，PBS洗滌 2 次，用含2% FBS溶液的PBS將細(xì)胞重懸。避光加入細(xì)胞表面抗體，4 ℃避光孵育20 min，1 500 r/min，離心5 min。收集細(xì)胞，每孔加入100 μL破膜劑，4 ℃孵育20 min。加入抗IFN-γ抗體，4 ℃避光孵育30 min；每管加入500 μL細(xì)胞染色溶液，重懸，轉(zhuǎn)移到Falcon 圓底試管中上機檢測。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0分析數(shù)據(jù)實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用單因素方差分析檢驗多組平均數(shù)之間的差別，用GraphPad Prism軟件繪圖，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MAGEC2 HLA-A2限制性CTL表位的預(yù)測結(jié)果

為了預(yù)測MAGEC2蛋白開放閱讀框中潛在的HLA-A*0201限制性CTL表位，依據(jù)NetCTL 1.2、SYFPEITHI和IEDB軟件的結(jié)果，選取在各個預(yù)測軟件中分值排名靠前的表位肽，根據(jù)這3個預(yù)測軟件進(jìn)行綜合打分，篩選出分值在各個軟件中打分較好的CTL表位肽，對篩選的表位肽進(jìn)行氨基酸替換，軟件預(yù)測改造表位打分情況見表1。候選表位肽由上海生工生物工程有限公司合成，用質(zhì)譜儀測定其分子量，結(jié)果顯示各多肽分子量測定值與理論值相符，表明合成的多肽是我們所需要的目的肽，見表2。

表1 MAGEC2 HLA-A2限制性CTL表位預(yù)測結(jié)果

2 表位肽/HLA-A2分子結(jié)合力實驗結(jié)果

T2結(jié)合力實驗測試表位肽與HLA-A*0201的結(jié)合能力。使用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測，對所得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果表明P248、P248-1Y、P248-2L、P356、P356-1Y、P356-2L和P356-1Y2L均具有較好結(jié)合力(FI>0.5)，見表2。這一結(jié)果表明，經(jīng)過改造后的表位肽與MHC分子的結(jié)合能力明顯提高。

表2候選肽與HLA-A*0201分子結(jié)合力結(jié)果

Table 2. The HLA-A*0201 binding affinity of the peptides derived from MAGEC2

PeptideESI?MS[M+H]+CalculatedObservedFIP228970．2971．20．36P228?1Y1046．31047．20．46P2481042．21042．50．86P248?1Y1106．31105．41．82P248?2L1042．21042．31．06P3171019．21021．60．24P317?1Y1035．21032．70．48P356922．1922．30．76P356?1Y986．1986．51．28P356?2L904．0905．21．08P356?1Y2L968．1969．81．87HBcAg18?271155．31155．61．24

FI=[mean fluorescence intensity (MFI) of the peptide-MFI background]/MFI background.

3 IFN-γ分泌水平結(jié)果

為了檢測表位肽是否可被MAGEC2抗原特異性的CD8+T細(xì)胞識別，根據(jù)結(jié)合力的實驗結(jié)果，我們選擇了較好結(jié)合力的多肽進(jìn)行實驗，結(jié)果顯示，P248、P248-1Y、P356、P356-1Y、P356-2L和P356-1Y2L多肽疫苗能檢測到特異性T細(xì)胞免疫，能分泌較多的IFN-γ，且P248-1Y和P356-1Y2L誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞免疫分泌的IFN-γ略高于原肽(P<0.05)，見圖1。

4 細(xì)胞毒實驗結(jié)果

根據(jù)IFN-γ分泌水平結(jié)果，我們將有效果的P248、P248-1Y、P356和P356-1Y2L的免疫活性進(jìn)行進(jìn)一步檢測。P248和P248-1Y這2條候選肽誘導(dǎo)得到的CTL在效靶比為50∶1時對靶細(xì)胞的殺傷率分別是(29.5±3.56)%和(36.3±3.26)%，P356和P356-1Y2L這2條候選肽誘導(dǎo)得到的CTL在效靶比為50∶1時對靶細(xì)胞的殺傷率分別是(26.5±3.02)%和(38.6±2.32)%，與陰性對照組(PBS組)和無關(guān)肽組(HBcAg18-27組)比較均顯著升高，見圖2。

Figure 1. ELISPOT assay was conducted to measure IFN-γ release by CTLs induced from the PBMCs of healthy donors. CTLs induced by PBS and irrelevant peptide HBcAg18-27were taken as negative controls. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsPBS group；▲P<0.05vsP248 group；#P<0.05vsP356 group.

圖1ELISPOT法檢測MAGEC2候選表位肽誘導(dǎo)特異性CTL分泌IFN-γ的能力

Figure 2. Specific lysis of HepG2 cells by the CTLs generated from the PBMCs of healthy donor. CTLs were induced by MAGEC2-derived peptides and their analogues. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsPBS group；#P<0.05vsP248 group；△P<0.05vsP356 group.

圖2P248和P356候選肽及其類似物誘導(dǎo)得到的CTL在不同效靶比時對靶細(xì)胞HepG2的殺傷情況

5 胞內(nèi)因子染色法檢測T細(xì)胞釋放IFN-γ水平

使用胞內(nèi)因子染色法檢測多肽體外免疫刺激后IFN-γ分泌水平。以空載T2細(xì)胞和荷肽T2細(xì)胞作為靶細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果進(jìn)一步證實，P248、P248-1Y、 P356和P356-1Y2L候選肽可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的CD8+T細(xì)胞。P248、P248-1Y、P356和P356-1Y2L均能誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞分泌較多的IFN-γ。P248-1Y和P356-1Y2L誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞免疫分泌的IFN-γ略高于原肽，見圖3。

Figure 3. Specific CD8+T-cell responses to MAGEC2-derived peptides in PBMCs of healthy donor. Peptide-stimulated CD8+T cells from PBMC samples were examined for IFN-γ production in co-culture with T2 cells loa-ded with each of the peptides. Mean±SD.n=3.*P<0.05,vsPBS group；#P<0.05vsP248 group；△P<0.05vsP356 group.

圖3胞內(nèi)因子染色法檢測候選表位肽體內(nèi)誘導(dǎo)CTL分泌IFN-γ的能力

討 論

腫瘤疫苗已經(jīng)探索了一個多世紀(jì)，疫苗對于傳染病的巨大影響相比，它們提供了更多的希望。腫瘤疫苗主要集中在疾病治療上，這是一個更高的治療方案，現(xiàn)有的研究對于癌癥在免疫系統(tǒng)上的能力幾乎不了解[13]。針對腫瘤疫苗的另外的挑戰(zhàn)是患者的免疫系統(tǒng)受到損傷，抑制或衰老，不僅是因為腫瘤的負(fù)擔(dān)造成的，而是標(biāo)準(zhǔn)治療療法和有害的經(jīng)驗。新形式下，免疫效應(yīng)機制知識的快速增長以及免疫抑制分子信號正在發(fā)展[14]。除此之外，存在新的基因編輯工具和對癌癥患者免疫力的關(guān)鍵炎癥和免疫分子的相關(guān)研究。這些研究的快速增長帶給癌癥疫苗新的希望[15]。

肽的腫瘤疫苗是通過接種特定腫瘤相關(guān)抗原(tumor-associated antigen，TAA)的腫瘤特異性肽來誘導(dǎo)腫瘤特異性T細(xì)胞反應(yīng)。目前已經(jīng)開發(fā)出了激活或改善免疫系統(tǒng)來對抗腫瘤的方法[16]。腫瘤免疫療法是非常有前景的治療方法，該療法能激發(fā)免疫系統(tǒng)摧毀癌細(xì)胞，還可以選擇性接種針對TAA的合成肽、來源于TAA重組蛋白、病毒載體編碼重組TAA、TAA樹突狀細(xì)胞或DNA/RNA編碼的TAA。TAA相關(guān)肽的內(nèi)源性腫瘤特異性T細(xì)胞反應(yīng)是一個有前景的癌癥治療，原因是其易于使用，而且在許多臨床試驗顯示低毒性[17]。

MAGEC2在腫瘤組織和正常組織之間的差異表達(dá)，以及MAGEC2突出的免疫原性使其有希望成為腫瘤免疫治療的的靶標(biāo)。為了探索其治療潛力，鑒定該抗原中包含的優(yōu)勢CD8+T細(xì)胞表位是至關(guān)重要的。在本研究中，我們采用“反向免疫學(xué)”的方法篩選能夠誘導(dǎo)CTL反應(yīng)的新MAGEC2 HLA-A2限制性表位，并對其進(jìn)行表位錨定位點的改造。通過修飾MHC抗原結(jié)合槽中保守氨基酸分子可以改變這些多肽與MHC分子的親和力，結(jié)果是可以得到體內(nèi)誘導(dǎo)更為強烈的多克隆CTL應(yīng)答的所謂異變性多肽[18-19]。該多肽能識別野生型表位，排斥新植入的腫瘤以及原有腫瘤，這一概念在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者中使用黑色素瘤相關(guān)抗原gp100來源的免疫優(yōu)勢表位的實驗中得到證實[20]。gp100多肽在修飾后體內(nèi)免疫原性得到增強，這一點在更大規(guī)模的臨床試驗中得到證實，轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者陽性反應(yīng)的比例增加到75%以上，多于90%的患者手術(shù)切除Ⅰ到Ⅲ期。在體外，修飾肽誘導(dǎo)的CTL與天然肽誘導(dǎo)的CTL相比，對抗原的識別能力更強[21]。

在本次研究中，野生肽及其類似物的免疫原性已在體外實驗中展示，結(jié)果顯示野生肽以及類似物均能有效誘導(dǎo)MAGEC2+、HLA-A2+限制性CTL，能夠識別和裂解自然遞呈野生型MAGEC2表位的靶細(xì)胞。近年來，腫瘤免疫療法領(lǐng)域取得了顯著進(jìn)展[22-24]。然而，為了實現(xiàn)癌癥疫苗的進(jìn)一步發(fā)展，仍然有許多等待我們解決的問題。雖然這次研究鑒定出新的MAGEC2表位在體外表現(xiàn)出顯著的免疫原性潛能，但其在體內(nèi)抗腫瘤免疫誘導(dǎo)中的效力仍有待確定。需要HLA轉(zhuǎn)基因小鼠模型以及HLA分子轉(zhuǎn)染的小鼠腫瘤細(xì)胞系來鑒定MAGEC2表位體內(nèi)抗腫瘤效果。這是我們接下來進(jìn)一步要研究的內(nèi)容。

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