桂福強， 羅 鴻， 劉 洪， 朱 樺， 張 矛， 趙 渝

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院血管外科， 重慶 400016)

下肢靜脈性潰瘍(venous leg ulcer，VLU)是慢性靜脈功能不全(chronic venous insufficiency, CVI)最嚴重的臨床分級，全球成人發(fā)病率約為1%。VLU一旦形成，便經久不愈，不僅會嚴重影響患者工作和生活，而且還會給家庭帶來不小的醫(yī)療開銷[1]。CVI是下肢靜脈高壓導致的一系列綜合結果，包括靜脈瓣膜功能不全、深淺靜脈瓣膜功能障礙、靜脈返流或者阻塞[2]。早期CVI若不予以干預最終會導致皮膚微循環(huán)功能障礙，主要表現(xiàn)為炎癥因子浸潤、真皮微血管纖維蛋白沉積和局部低氧，最終發(fā)展為VLU。目前有研究發(fā)現(xiàn)VLU周圍經皮氧分壓可低至1.7～7.0 mmHg[3]，嚴重缺氧首先作用于皮膚微循環(huán)血管內皮細胞，使其凋亡和增殖之間的平衡發(fā)生紊亂，繼而出現(xiàn)皮膚潰瘍。

舒洛地特(sulodexide，SDX)是一種天然的糖胺聚糖，具有抗凝、抗炎和改善內皮細胞功能等作用，現(xiàn)以已被廣泛應用于治療包括靜脈血栓、靜脈曲張和靜脈性潰瘍等多種靜脈性疾病，且有系統(tǒng)評價稱SDX能有效提高VLU愈合率[4]。目前許多臨床研究表明SDX可以明顯降低靜脈性潰瘍周圍血管通透性、減少炎性因子分泌并加快靜脈性潰瘍的愈合，且在一些關于糖尿病腎病的研究中也報道了SDX對腎臟的保護作用[5]，但其具體作用機制尚不明確。依據(jù)下肢靜脈性潰瘍的病理生理特點和舒洛地特對靜脈性潰瘍明確的治療效果，我們提出猜想：舒洛地特可有效降低低氧狀態(tài)下人真皮微血管內皮細胞(human dermal microvascular endothelial cells，HDMECs)的凋亡率。本研究通過不同濃度的SDX作用于低氧狀態(tài)下人真皮微血管內皮細胞，探討SDX對細胞凋亡率的影響及分子機制。

材 料 和 方 法

1 主要材料與設備

人真皮微血管內皮細胞株購買于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院；SDX由意大利阿爾法韋士曼(北京)制藥公司上海分公司提供；兔抗人Bax、Bcl-2、caspase-3和P53多克隆抗體購于萬類生物有限公司；相應引物購于GeneCopoeia；蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒及Western blot常規(guī)試劑均購于碧云天生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購于東仁化學科技有限公司；caspase-3活性檢測試劑盒購于萬類生物有限公司；胎牛血清購于PAN-Biotech GmbH；RPMI-1640培養(yǎng)液購于Corning；TaKaRa逆轉錄試劑盒和SYBR Green均購于寶生物工程有限公司；三氣孵箱購于Thermo。

2 方法

2.1細胞的培養(yǎng)與實驗分組 HDMECs用含10%胎中血清和1%青、鏈霉素混合液的 RPMI-1640培養(yǎng)液，置于21% O2、5% CO2、37 ℃孵箱培養(yǎng)，待細胞生長至70%融合時，用不含血清的培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)24 h后，對細胞進行分組培養(yǎng)：(1)常氧對照(normoxia control，NC)組即用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)于常氧孵箱；(2)低氧對照(hypoxia control，HC)組即將細胞更換新鮮培養(yǎng)基后培養(yǎng)于1% O2、5% CO2、94% N2、37 ℃細胞培養(yǎng)孵箱培養(yǎng)24 h；(3)不同濃度(0.25、0.5、1 LSU/mL)SDX組即細胞更換含不同濃度(0.25、0.5、1 LSU/mL)SDX的新鮮完全培養(yǎng)基后移至1% O2、5% CO2、94% N2、37 ℃細胞培養(yǎng)孵箱培養(yǎng)24 h。

2.2CCK-8法檢測細胞活力 將HDMECs以每孔5×103接種至96孔板中，每個孔板中添加完全培養(yǎng)基，置于21% O2、5% CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中至細胞融合，然后換液加含不同濃度(0、0.25、0.5、1 LSU/mL)SDX的完全培養(yǎng)基各加100 μL，分別在5% CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)孵箱與1% O2、5% CO2、94% N2、37 ℃細胞培養(yǎng)孵箱培養(yǎng)24 h后，每孔添加10 μL CCK-8試劑(每孔)反應2 h，用酶標儀測定450 nm波長吸光度(A)值，實驗重復6次，根據(jù)不同處理濃度A值與對照組A值的比例計算HDMECs的細胞活力。

2.3Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測細胞凋亡 Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測細胞凋亡根據(jù)試劑盒說明書操作，主要過程將細胞按以上分組方式培養(yǎng)后，收集細胞，PBS洗滌2次，500 μL反應緩沖液垂懸細胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，混合后于室溫避光靜置10 min，上流式細胞儀檢測，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長 530 nm,計算各時相細胞百分比，實驗重復3次。

2.4細胞內caspase-3活性測定 按以上分組方式培養(yǎng)細胞后，收集各組細胞并用PBS洗滌1次，用裂解液冰浴裂解15 min，4 ℃條件下12 000×g離心15 min，采用Bradford法檢測上清液中蛋白濃度。在96孔板中將10 μL蛋白上清液、80 μL反應緩沖液和10 μL caspase-3底物混合并在37 ℃條件下孵育2 h。利用多功能酶標儀于405 nm處讀取A值，實驗重復3次，并以各組吸光度與常氧對照組吸光度相比計算相對的caspase-3活性。

2.5Western blot檢測蛋白表達 按以上分組方式培養(yǎng)細胞后收集各組細胞用RIPA裂解液裂解后靜置30 min，然后4 ℃、12 000×g離心15 min取上清液即為總蛋白。BCA法測定蛋白濃度并配平。SDS-PAGE約2 h，用電轉移法將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶-TBST室溫封閉1.5 h，加入 I 抗4 ℃過夜。經 II 抗室溫孵育1.5 h和洗膜后將膜置于顯影儀使用ECL發(fā)光試劑進行顯影。以目的蛋白與內參照GAPDH條帶光吸光度之比表示目的蛋白的相對表達水平，實驗重復3次。

2.6Real-time PCR檢測mRNA的表達 按以上分組方式培養(yǎng)細胞后收集各組細胞，按照總RNA提取試劑盒說明書步驟提取RNA，測RNA濃度，取1 μL RNA按照TaKaRa逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄反應，測DNA濃度。進而通過特異性引物(表1)對HDMECs中的P53、Bax、Bcl-2和內參照GAPDH進行PCR擴增。10 μL PCR反應體系包括：1 μL逆轉錄反應產物、5 μL SYBR Green、3 μL DEPC水和1 μL上、下游混合引物。在CFX96實時熒光定量PCR儀上進行反應，共40個循環(huán)，循環(huán)結束后繪制熔解曲線。每次擴增均設置GAPDH內參照，用2-ΔΔCt方法分析數(shù)據(jù)。

表1 引物序列

3 統(tǒng)計學處理

所有實驗均獨立重復3次，計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件對實驗結果進行統(tǒng)計分析，兩組獨立樣本均數(shù)比較采用Studentt檢驗；多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(在此基礎上的組間兩兩比較采用SNK-q法)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 SDX對常氧及低氧狀態(tài)下的HDMECs存活率的影響

CCK-8實驗結果顯示，常氧狀態(tài)下，各組HDMECs存活率沒有明顯差異；與常氧不加藥組細胞對比，低氧不加藥組細胞存活率明顯降低(P<0.05)；低氧狀態(tài)下，與低氧對照組比較，SDX處理組HDMECs的存活率存在明顯差異，且隨濃度增加存活率增加(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. The effect of SDX on the viability of HDMECs under normoxic and hypoxic condition. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNC group；#P<0.05vsHC group；△P<0.05vs0.25 LSU/mL SDX group；▲P<0.05vs0.5 LSU/mL SDX group.

圖1常氧及低氧狀態(tài)下SDX對HDMECs活力的影響

2 SDX對低氧狀態(tài)下HDMECs凋亡率的影響

流式細胞儀結果顯示，與常氧對照組相比，低氧對照組細胞凋亡率明顯增高(P<0.05)。與低氧對照組相比，SDX處理組細胞凋亡率顯著降低，并隨著濃度增高細胞凋亡率降低(P<0.05)，見圖2。

Figure 2. The effect of SDX on the apoptotic rate of HDMECs under hypoxic condition. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group；#P<0.05vsHC group；△P<0.05vs0.25 LSU/mL SDX group；▲P<0.05vs0.5 LSU/mL SDX group.

圖2SDX對低氧狀態(tài)下HDMECs凋亡率的影響

3 SDX對低氧狀態(tài)下HDMECs內caspase-3活性的影響

Caspase-3活性試劑盒檢測結果顯示，與常氧對照組比較，低氧對照組caspase-3活性顯著升高(P<0.05)；與低氧對照組相比，SDX各處理組caspase-3活性明顯降低，且隨濃度增加caspase-3活性呈降低趨勢(P<0.05)，見圖3。

Figure 3. The effects of SDX on the activity of caspase-3 in the HDMECs under hypoxic condition. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group；#P<0.05vsHC group；△P<0.05vs0.25 LSU/mL SDX group；▲P<0.05vs0.5 LSU/mL SDX group.

圖3SDX對低氧狀態(tài)下HDMECs內caspase-3活性的影響

4 SDX對低氧狀態(tài)下HDMECs凋亡相關分子mRNA的表達的影響

Real-time PCR結果顯示，與常氧對照組相比， 低氧對照組促凋亡因子P53、Bax和caspase-3表達均有明顯上升(P<0.05)，抑凋亡因子Bcl-2表達明顯下降(P<0.05)；與低氧對照組相比，SDX處理組促凋亡因子P53、Bax和caspase-3 mRNA表達均有顯著下降，而凋亡抑制因子Bcl-2有明顯上升(P<0.05)，呈現(xiàn)顯著的濃度依賴性，見圖4。

Figure 4. The effects of SDX on the mRNA expression of apoptosis-related factors in the HDMECs. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group；#P<0.05vsHC group；△P<0.05vs0.25 LSU/mL SDX group；▲P<0.05vs0.5 LSU/mL SDX group.

圖4SDX對HDMECs凋亡相關因子mRNA表達的影響

5 SDX對低氧狀態(tài)HDMECs凋亡相關因子蛋白表達的影響

與real-time PCR的結果相似，Western blot結果顯示，低氧對照組較常氧對照組比較，P53、Bax和caspase-3蛋白表達均明顯上調(P<0.05)，Bcl-2明顯下調(P<0.05)；與低氧對照組相比，各SDX處理組P53、 Bax和caspase-3蛋白表達均有顯著下調(P<0.05)，Bcl-2有明顯上調(P<0.05)，呈現(xiàn)顯著的濃度依賴性，見圖5。

Figure 5. The effects of SDX on the expression of apoptotsis-related proteins in the HDMECs. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group；#P<0.05vsHC group；△P<0.05vs0.25 LSU/mL SDX group；▲P<0.05vs0.5 LSU/mL SDX group.

圖5SDX對各組HDMECs凋亡相關蛋白表達的影響

討 論

長期靜脈血液回流不暢導致血流淤滯和靜脈高壓，進而出現(xiàn)皮膚血管微循環(huán)白細胞介導炎性反應、血小板黏附、毛細血管周圍纖維囊形成、大分子物質堆積于局部組織等，導致組織缺氧和血管內皮細胞死亡，最終形成潰瘍[6-7]。許多靜脈性潰瘍的臨床研究已證實，靜脈性潰瘍患者其潰瘍周圍都存在不同程度的缺氧[8-9]，且在老年性靜脈性潰瘍患者中潰瘍周圍組織經皮氧分壓低至1.7～7.0 mmHg[3]，如此程度的缺氧與許多由動脈缺血性低氧(包括動脈粥樣硬化性下肢缺血和糖尿病病足下肢缺血)程度相似。目前對動脈缺血性低氧損害血管內皮細胞的體外機制研究較多，而靜脈性潰瘍的體外低氧細胞損害的研究卻很少，以致缺少統(tǒng)一的體外細胞模型。體外細胞低氧培養(yǎng)模型有使用CoCl2處理細胞的化學低氧模型和通過三氣培養(yǎng)孵箱培養(yǎng)細胞的物理低氧模型。這兩種低氧模型各有利弊，但不少學者因為擔心CoCl2可能會對細胞內其它某些蛋白會產生影響而采用物理模型。雖然目前尚沒有成熟的靜脈性潰瘍體外細胞低氧培養(yǎng)模型，但已有缺血再灌注的缺氧/復氧模型、動脈缺血的低氧-無糖模型以及糖尿病病足的低氧-高糖模型做參考，依據(jù)靜脈性潰瘍缺氧程度相似的動脈缺血性低氧的體外低氧模型而采用1% O2濃度培養(yǎng)細胞24 h較多[10-11]，所以本研究在低氧程度上參考動脈體外研究模型采用1% O2氧濃度培養(yǎng)HDMECs 24 h以模擬靜脈性潰瘍局部嚴重缺氧情況。通過體外培養(yǎng)細胞并使用SDX干預后探索其治療靜脈性潰瘍的潛在機制。

大量研究表明低氧可以導致內皮細胞產生一系列的細胞間相互級聯(lián)反應，包括：細胞有氧代謝障礙、細胞膜結構改變、炎癥因子釋放和細胞凋亡等，而在靜脈性潰瘍中嚴重低氧長時間作用微血管內皮細胞的最終結局是細胞凋亡。

細胞凋亡是一種細胞程序性死亡，由多種分子間的相互作用控制，負責清除體內不需要的細胞。細胞凋亡通過外部的細胞死亡信號觸發(fā)。不同的蛋白家族如caspase家族、Bcl-2家族、TNF受體家族和P53都直接或間接參與細胞的凋亡[12]。p53是第一個被證實的腫瘤抑制基因，在各種應激情況下(包括低氧、癌基因激活、DNA損傷和核苷酸缺失等)調控細胞周期、細胞凋亡以及細胞衰老的過程[13-14]。在低氧條件的刺激下，促凋亡因子P53表達增加，并介導下游多種細胞凋亡相關因子包括Bcl-2家族、IGF-BP3、P53誘導基因(PIGs)等的表達。本研究中發(fā)現(xiàn)，與常氧狀態(tài)比較，低氧狀態(tài)下HDMECs的P53表達明顯升高。在低氧導致的內皮細胞凋亡的過程中，線粒體性細胞凋亡扮演著重要的角色，P53通過對Bcl-2家族的介導進而調控線粒體性細胞凋亡。通常認為Bcl-2家族成員中促凋亡蛋白Bax與抑凋亡蛋白Bcl-2的表達比例以及二者形成的二聚體決定細胞的存活和凋亡[15]。本研究也發(fā)現(xiàn)，與常氧對照，低氧狀態(tài)下HDMECs中Bax/Bcl-2比例增高，且流式結果顯示凋亡率明顯增加。在普遍細胞凋亡過程中， caspase是執(zhí)行細胞凋亡的主要酶類，負責選擇性的切割某些蛋白質，從而導致細胞凋亡，其中caspase-3是核心蛋白酶，裂解蛋白質后通過正反饋調節(jié)，產生caspase級聯(lián)反應，最終導致細胞凋亡[16]。在本研究結果中可看出低氧情況下HDMECs表達caspase-3明顯增高，且活性也明顯增高。

舒洛地特是屬于糖胺聚糖類物質，具有很高的血管壁趨向性，在多項臨床研究中表明它具有抗凝、抗炎和改善內皮細胞功能等作用[17-20]。低氧狀態(tài)下血管內皮細胞間糖胺聚糖含量減少時，它提供有效的糖胺聚糖以維持內皮細胞的結構和穩(wěn)定性，改善糖胺聚糖代謝平衡，提高血管內皮細胞膜表面多糖-蛋白質復合物，有助于細胞膜抵抗外界炎癥因子以及氧自由基對細胞的損傷，從而降低細胞的凋亡[21]。本研究的CCK-8實驗結果表明，常氧下SDX對HDMECs無毒性作用，低氧下隨SDX濃度增高HDMECs存活率明顯增加。同時在分子和基因層面，SDX能有效降低低氧狀態(tài)下HDMEsC的凋亡率、降低促凋亡因子P53、Bax和caspase-3蛋白和mRNA表達，提高抗凋亡因子Bcl-2的蛋白和mRNA表達。在2項動脈性缺血的基礎研究中發(fā)現(xiàn)，SDX在濃度為0.125～0.5 LSU/mL和0.5 LSU/mL時，可以減少低氧下血管內皮細胞的炎性因子釋放，有抗細胞衰老和抗細胞凋亡的作用[22-23]。可見SDX對低氧狀態(tài)下內皮細胞存在顯著的抗凋亡作用并呈現(xiàn)濃度依賴性，且其抗凋亡機制可能與線粒體凋亡通路(P53-Bax/Bcl-2-caspase-3)相關。

綜上所述，本研究證實了低氧導致的HDMECs凋亡與凋亡通路P53-Bax/Bcl-2-caspase-3相關，并首次提出舒洛地特對其有抑制作用，且抑制效果呈濃度依賴性，此結果為舒洛地特治療靜脈性潰瘍的分子機制提供了依據(jù)。未來將更深入地研究舒洛地特降低血管內皮的低氧損傷深層機制及其作用靶點，以期發(fā)現(xiàn)逆轉或降低血管內皮細胞低氧損傷更有效的治療方式。

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